張 薇 田 維 王彬彬*

1. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院(100730)；2. 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所；3. 天津醫(yī)院

*通訊作者：wbbahu@163.com

DLX3基因罕見變異與發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良

張 薇1,2田 維3王彬彬1,2*

1. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院(100730)；2. 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所；3. 天津醫(yī)院

目的：篩查DLX3基因(NM_005220)中發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(DDH)相關(guān)的致病變異。 方法：本研究對192例DDH患者和188例健康對照組的DLX3基因全部外顯子區(qū)進(jìn)行Sanger測序，排除已知高頻單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(最小等位基因頻率MAF ≥ 1%)和對照組中存在的變異位點，結(jié)合功能性預(yù)測和保守性分析，最終篩選出DDH候選致病變異。 結(jié)果：經(jīng)過分析，最終在一個DDH患者中篩選出一個錯義雜合變異 DLX3 c. G736C: p. D246H(rs3744539)可能為其致病突變，此變異在物種進(jìn)化過程中高度保守且致病的可能性較高。 結(jié)論：本研究首次對DLX3整個外顯子區(qū)進(jìn)行變異篩查，并發(fā)現(xiàn)新的DDH候選致病變異 p. D246H。

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良；DLX3基因；錯義變異；致病突變

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(DDH)是小兒骨科常見的先天性畸形，嚴(yán)重危害兒童的骨骼生長發(fā)育和身體健康[1-2]。DDH的發(fā)病率因地域、物種和經(jīng)濟(jì)醫(yī)療條件的不同而有所差異，全球總發(fā)病率在1.4‰～35‰，中國約1‰～5‰，女性的發(fā)病率顯著高于男性(4～10:1)且左側(cè)受累多于右側(cè)[3-4]。DDH是一個世界范圍內(nèi)的醫(yī)學(xué)難題，若能早期診斷并及時治療，大部分患兒可完全正常發(fā)育；若治療延誤，將導(dǎo)致患兒最終形成不可逆的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎和不同程度的殘疾，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量，給家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。目前，DDH的發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確，研究表明遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致疾病的發(fā)生[3]。子宮內(nèi)約束、羊水過少、臀位妊娠、初產(chǎn)、高出生體重和襁褓包裹不當(dāng)?shù)榷伎赡転镈DH的高風(fēng)險環(huán)境因素[5]。流行病學(xué)和家系分析等研究表明，DDH具有明顯的家族聚集性，遺傳因素在疾病發(fā)生中起重要作用，同卵雙胞胎比異卵雙胞胎具有更高的一致性，DDH患者的一級親屬更易受到影響[6-7]。目前，已發(fā)現(xiàn)多個可能與DDH發(fā)生相關(guān)的候選基因，如HOX家族基因(HOXA， HOXB，HOXD)，膠原相關(guān)基因(COL1A1，COL1A2)，生長分化因子基因GDF5，雌激素受體基因ER和DLX家族基因DLX3，DLX4，DLX5等[4,8]。本研究對整個DLX3外顯子區(qū)進(jìn)行突變篩查，以期發(fā)現(xiàn)新的致病變異，為疾病的遺傳學(xué)研究和分子診斷提供新的思路。

1 研究對象與方法

1.1研究對象

本研究納入的192例DDH患者(DDH組)均來自于天津醫(yī)院創(chuàng)傷外科，所有患者均由至少2名骨?？漆t(yī)師根據(jù)病史、體格檢查、骨盆X光和CT照片結(jié)果進(jìn)行確診，且無其他綜合征表型。健康對照組樣本來自該院體檢中心，將無任何髖關(guān)節(jié)和其他先天畸形、無遺傳性疾病與DDH家族史的人群，按照性別、年齡和民族(研究對象均自述為漢族)相匹配的原則納入188例研究對象作為對照組。上述DDH組和對照組中的研究對象均為不相關(guān)個體，彼此無血緣關(guān)系。本研究中所涉及的血液采集、臨床信息資料收集等均通過天津醫(yī)院與國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會批準(zhǔn)，全部研究對象均由本人或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書，并在本人及家屬知情的情況下進(jìn)行。研究對象無菌采集外周靜脈血2ml于EDTA抗凝管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增本研究采用QIAGEN公司QIAampDNA Blood Mini Kit(Cat. No.51106)試劑盒提取研究對象血液樣本的基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照配套說明書進(jìn)行，并利用Nanodrop 2000分光光度計檢測各樣本DNA的濃度與OD260/OD280的比值(比值在1.6～1.8符合要求)。在UCSC數(shù)據(jù)庫下載DLX3(NM_005220)基因序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計3對匹配引物使擴(kuò)增區(qū)域包含3個外顯子及外顯子前后各100bp區(qū)域，引物信息見表1。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到病例組(192例)和對照組(188例)特定區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行Sanger測序。

1.2.2測序結(jié)果比對及分析首先，利用Chromas 2軟件判斷測序質(zhì)量，使用MegAlign軟件將DDH組測序數(shù)據(jù)與DLX3基因序列進(jìn)行比對以尋找潛在的變異位點并進(jìn)行記錄。其次，排除DDH組和健康對照組中同時存在的位點。然后，利用ExAC Browser在線數(shù)據(jù)庫排除高頻SNP位點(MAF≥1%)。最后，利用生物信息學(xué)軟件對變異位點進(jìn)行保守性預(yù)測、功能性預(yù)測和有害性預(yù)測，結(jié)合其可能對蛋白質(zhì)功能和氨基酸性質(zhì)所造成的生化機(jī)制的改變，最終確定DDH候選致病變異。

表1 DLX3外顯子區(qū)擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1確定DLX3 c. G736C: p. D246H變異

測序數(shù)據(jù)經(jīng)過序列比對、排除以及預(yù)測等流程，最終在一個DDH患者中篩選出一個錯義雜合變異 DLX3 c. G736C: p. D246H(rs3744539)(圖1-A)。p. D246H導(dǎo)致酸性天冬氨酸變?yōu)閴A性組氨酸，變異在ExAC Browser數(shù)據(jù)庫中頻率為0.000 7059，在亞洲人群中的比例0.009 727，屬較罕見變異(Freq<1%)，且在健康對照組中未被發(fā)現(xiàn)。變異由Polyphen-2，SIFT和MutationTaster在線預(yù)測軟件皆預(yù)測為致病性或可能致病(表2)，且在物種進(jìn)化過程中高度保守(圖1-B)。這位變異攜帶者由骨科專家根據(jù)體格檢查、骨盆X光片和CT掃描片綜合診斷為DDH疾病(圖1-C, D)。

表2 DLX3 p. D246H 變異有害性預(yù)測

a.Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/). 預(yù)測分值范圍0～1，分值越高表示危害性越大

b.SIFT (http://sift.jcvi.org/). 預(yù)測分值范圍0～1，分值越接近于0危害性越大

c.Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/). 分值大小表示預(yù)測結(jié)果的可信度，分值越接近于1表示預(yù)測的可信度越高

A：錯義雜合變異 DLX3 c. G736C；B：變異位點在物種進(jìn)化過程中高度保守(人類、家牛、綿羊、小鼠和大鼠)；C: 變異攜帶者骨盆X光片；D: 變異攜帶者CT掃描片

圖1發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良變異攜帶者基因比對及病例情況

3 討論

DLX家族是HOX家族的分支之一，同屬于同源異型盒基因家族，DLX家族基因參與調(diào)控胚胎形態(tài)發(fā)生，是骨骼發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子[8]。多個連鎖分析表明染色體17q21-22區(qū)域可能與DDH和骨質(zhì)疏松等疾病表型相關(guān)，DLX3，DLX4與DLX5均位于這段DDH易感區(qū)域，可推測DLX基因與先天性骨骼畸形發(fā)生有關(guān)[9-10]。近幾年，基于動物模型的研究，如DLX1與DLX2基因敲除小鼠出現(xiàn)異位骨成分，DLX5敲除小鼠長骨骨化輕度延遲，敲除或特異性抑制DLX3/DLX5的表達(dá)可顯著抑制成骨細(xì)胞的基質(zhì)成熟和礦化，以上研究更加提示了DLX家族基因?qū)C(jī)體骨骼生長發(fā)育的重要性[11-12]。田維[13]前期對DLX3，DLX4和DLX5共8個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)進(jìn)行DDH病例-對照關(guān)聯(lián)性分析，其中有5個位點與DDH密切相關(guān)，首次證明DLX3和DLX4基因可能與DDH的易感性相關(guān)。此外，研究學(xué)者們通過家系傳遞不平衡檢驗和連鎖分析等研究策略，證實染色體17q21-17q22區(qū)域與DDH疾病的發(fā)生密切相關(guān)，而DLX家族基因DLX3，DLX4與DLX5均位于此DDH易感區(qū)域，進(jìn)一步可推測DLX家族基因與DDH的發(fā)生具有緊密的聯(lián)系[9-10,14]。

DLX3，位于染色體17q21，包含3個外顯子，屬DLX家族6個基因(DLX1-DLX6)中的一員，其編碼的蛋白質(zhì)參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA和染色質(zhì)結(jié)合，在顱面模型、形態(tài)發(fā)生、皮膚和骨骼發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用[15]。多個研究表明，DLX3基因的移碼突變和缺失突變都可能導(dǎo)致一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病毛發(fā)-牙-骨綜合征(TDO)的發(fā)生，此病以頭發(fā)卷曲、牙釉質(zhì)發(fā)育不良、牙冠長根短和骨皮質(zhì)增厚為特征[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，DLX3基因敲除小鼠在胚胎期9.5～10d死亡，因此無法觀察其由于基因缺失導(dǎo)致的具體表型變化[19]。截止目前，只發(fā)現(xiàn)DLX3基因rs2278163，rs12452477和rs2303466這3個位點與DDH疾病相關(guān)，即3個位點的T，T，A等位基因和TT，CT(TT)，AA基因型可能是發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的風(fēng)險因子[13]。然而，DDH 是一種復(fù)雜的遺傳病，不同個體之間存在很大的遺傳異質(zhì)性，且單純的關(guān)聯(lián)分析只能對少數(shù)位點進(jìn)行研究，遠(yuǎn)不及探索整個候選致病基因或基因編碼區(qū)與疾病的研究系統(tǒng)性強(qiáng)。

本研究首次針對DLX3基因全外顯子區(qū)進(jìn)行突變篩查，并發(fā)現(xiàn)一個新的候選致病變異DLX3 c. G736C: p. D246H，變異導(dǎo)致第246位酸性天冬氨酸變?yōu)閴A性組氨酸。變異所在位點在物種進(jìn)化過程中高度保守，且多個預(yù)測軟件顯示變異的致病可能性較大，其中MutationTaster預(yù)測變異可能導(dǎo)致選擇性剪切位點的改變。DLX3蛋白由三個主要區(qū)域組成，分別為N端和C端反式激活結(jié)構(gòu)域以及中間的同源結(jié)構(gòu)域。其中，同源結(jié)構(gòu)域在機(jī)體多個生長發(fā)育階段可與DNA特異性相互作用以調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)[20]。因此，同源結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守性氨基酸的突變往往導(dǎo)致較為嚴(yán)重的臨床表型[21]。而兩端反式激活結(jié)構(gòu)域的缺失會導(dǎo)致DLX3作為轉(zhuǎn)錄因子功能的下降，表明這些副結(jié)構(gòu)域在同源結(jié)構(gòu)域-DNA結(jié)合中也發(fā)揮著較為重要的作用[20]。據(jù)報道，DLX3同源結(jié)構(gòu)域內(nèi)p.Q178R變異導(dǎo)致TDO疾病發(fā)生的可能機(jī)制為降低了RUNX2，OCN和p53等蛋白的表達(dá)，減少骨的生成以及延緩衰老功能的下降[22]。C端結(jié)構(gòu)域變異p. D246H是否通過類似機(jī)制參與DDH疾病的發(fā)生，有待進(jìn)一步深入探索。

由于DDH發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，且家系樣本采集困難，DDH的遺傳學(xué)研究多集中于散發(fā)樣本的關(guān)聯(lián)分析或候選基因突變篩查，局限性較大，且發(fā)現(xiàn)的少數(shù)基因突變只能解釋很小一部分DDH病例的發(fā)生。隨著高通量測序技術(shù)與大數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析的發(fā)展和成熟，基于高發(fā)家系的全基因組測序、全外顯子組測序及其他高通量測序?qū)镈DH等復(fù)雜性疾病的致病基因鑒定帶來廣闊的前景。

[1] Sherk HH, Pasquariello PJ, Watters WR. Congenital dislocation of the hip. A review[J]. Clin Pediatr (Phila), 1981, 20(8): 513-520.

[2] Kotlarsky P. Developmental dysplasia of the hip: What has changed in the last 20 years?[J]. World Journal of Orthopedics, 2015, 6(11): 886.

[3] de Hundt M, Vlemmix F, Bais JMJ, et al. Risk factors for developmental dysplasia of the hip: a meta-analysis[J]. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 2012, 165(1): 8-17.

[4] Li L, Wang X, Zhao Q, et al. CX3CR1 polymorphisms associated with an increased risk of developmental dysplasia of the hip in human[J]. Journal of Orthopaedic Research, 2017, 35(2): 377-380.

[5] Stein-Zamir C, Volovik I, Rishpon S, et al. Developmental dysplasia of the hip: risk markers, clinical screening and outcome[J]. Pediatr Int, 2008, 50(3): 341-345.

[6] Li L, Sun K, Zhang L, et al. Heritability and sibling recurrent risk of developmental dysplasia of the hip in Chinese population[J]. Eur J Clin Invest, 2013, 43(6): 589-594.

[7] Sionek A, Czubak J, Kornacka M, et al. Evaluation of risk factors in developmental dysplasia of the hip in children from multiple pregnancies: results of hip ultrasonography using Graf's method[J]. Ortop Traumatol Rehabil, 2008, 10(2): 115-130.

[8] 李照彥，鐘磊，王金成. 發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良遺傳易感基因研究進(jìn)展[J]. 中國體視學(xué)與圖像分析, 2016(03): 344-350.

[9] 李連永. 17q21區(qū)域發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位易感基因的定位、鑒定與初步功能研究[D]. 中國醫(yī)科大學(xué), 2009.

[10] Feldman G, Dalsey C, Fertala K, et al. The Otto Aufranc Award: Identification of a 4 Mb region on chromosome 17q21 linked to developmental dysplasia of the hip in one 18-member, multigeneration family[J]. Clin Orthop Relat Res, 2010, 468(2): 337-344.

[11] Dlx3 Transcriptional Regulation of Osteoblast Differentiation: Temporal Recruitment of Msx2, Dlx3, and Dlx5 Homeodomain Proteins to Chromatin of the Osteocalcin Gene[J].

[12] Acampora D, Merlo GR, Paleari L, et al. Craniofacial, vestibular and bone defects in mice lacking the Distal-less-related gene Dlx5[J]. Development, 1999, 126(17): 3795-3809.

[13] 田維.發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的遺傳學(xué)研究[D].天津醫(yī)科大學(xué),2015:10.

[14] 姜俊，麻宏偉，盧瑤，等. 先天性髖脫位與HOXB9基因或COL1A1基因傳遞不平衡研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2003(03): 21-23.

[15] Hwang J, Mehrani T, Millar S E, et al. Dlx3 is a crucial regulator of hair follicle differentiation and cycling[J]. Development, 2008, 135(18): 3149-3159.

[16] Duverger O, Lee D, Hassan M Q, et al. Molecular consequences of a frameshifted DLX3 mutant leading to Tricho-Dento-Osseous syndrome[J]. J Biol Chem, 2008, 283(29): 20198-20208.

[17] Price JA, Wright JT, Kula K, et al. A common DLX3 gene mutation is responsible for tricho-dento-osseous syndrome in Virginia and North Carolina families[J]. J Med Genet, 1998, 35(10): 825-828.

[18] Wright JT, Hong SP, Simmons D, et al. DLX3 c.561_562delCT mutation causes attenuated phenotype of tricho-dento-osseous syndrome[J]. Am J Med Genet A, 2008, 146A(3): 343-349.

[19] Morasso MI, Grinberg A, Robinson G, et al. Placental failure in mice lacking the homeobox gene Dlx3[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96(1): 162-167.

[20] Feledy JA, Morasso MI, Jang SI, et al. Transcriptional activation by the homeodomain protein distal-less 3[J]. Nucleic Acids Res, 1999, 27(3): 764-770.

[21] Li Y, Han D, Zhang H, et al. Morphological analyses and a novel de novo DLX3 mutation associated with tricho-dento-osseous syndrome in a Chinese family[J]. Eur J Oral Sci, 2015, 123(4): 228-234.

[22] Zhao N, Han D, Liu H, et al. Senescence: novel insight into DLX3 mutations leading to enhanced bone formation in Tricho-Dento-Osseous syndrome[J]. Sci Rep, 2016, 6: 38680.

RarevariantofDLX3geneanddevelopmentaldysplasiaofthehip

ZHANG Wei1,2, TIAN Wei3, WANG Binbin1,2*

1.GraduateSchoolofPekingUnionMedicalCollege,Beijing, 100730; 2.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning;3.TianjinHospital

Objective: To screen pathogenic variants associated with developmental hip dysplasia (DDH) in the DLX3 gene. Methods: 192 patients with DDH and 188 healthy research objects were recruited in this study. All exons coding of DLX3 of the included objects were amplified and sanger sequenced. The known high frequency SNPs (minimum allele frequency≥1%) and variation locus carried by healthy research objects were excluded, and the candidate pathogenic variant of DDH was selected ultimately through functional prediction combined with conservative analysis. Results: A heterozygous missense variant c. G736C: p. D246H (rs3744539) was identified in a patient and it was absent in healthy research objects. This variant was highly conserved in evolution of species and was predicted to be deleterious to the function of DLX3 protein. Conclusion: It is the first time to screen the entire exon region of DLX3 and to found a new DDH candidate pathogenic variant p. D246H.

Developmental dysplasia of the hip; DLX3 gene; Missense variant; Pathogenic mutations

10.3969/j.issn.1004-8189.2017.07.004

2017-03-23

2017-04-03

*Correspondingauthor:wbbahu@163.com

[責(zé)任編輯：王麗娜]