劉少軍　胡坤華　劉慰華

【摘要】 目的：從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度探討C-反應(yīng)蛋白（CRP）損傷內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的作用機(jī)制。方法：采用培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞HCAEC第4代用于實(shí)驗(yàn)，25 ?g/mL CRP刺激HCAEC 24 h，2D DIGE結(jié)合MALDI-ToF-ToF質(zhì)譜鑒定進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)11個(gè)，鑒定出其中4個(gè)，包括Heat shock cognate 71 kDa protein、Elongation factor 1-beta和Proteasome activator complex subunit 1等。結(jié)論：通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選了CRP損傷EC的差異表達(dá)蛋白，為深入理解EC損傷的分子機(jī)制提供有益的線索。

【關(guān)鍵詞】 C-反應(yīng)蛋白； 內(nèi)皮細(xì)胞； 蛋白質(zhì)組學(xué)研究； 動(dòng)脈粥樣硬化

Proteomics Analysis of C-relative Protein Effect on Endothelial Cell/LIU Shao-jun，HU Kun-hua，LIU Wei-hua.//Medical Innovation of China，2017，14（19）：015-018

【Abstract】 Objective：To investigate the role of CRP in endothelial cell by proteomics analysis.Method：Human coronary artery endothelial cells were used at passage 4.25 ?g/mL CRP served as stimulus for endothelial cell injury.Differentially expressed proteins were analyzed by 2D DIGE and identified by MALDI-ToF-ToF MS analysis.Result：Differentially expressed 11 spots were visualized and 4 were identified，including Heat shock cognate 71 kDa protein， Elongation factor 1-beta and Proteasome activator complex subunit 1.Conclusion：This study screen differentially expressed proteins by CRP stimulus via proteomics analysis，providing useful understand of the underlying molecular mechanism of endothelial cell injury.

【Key words】 C-relative protein； Endothelial cell； Proteomics analysis； Atherosclerosis

First-authors address：Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.19.005

在正常血清中，CRP（C-reactive protein，CRP）以微量形式存在。當(dāng)發(fā)生炎癥時(shí)，炎癥因子刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP，血清CRP顯著升高。因此，CRP是一個(gè)炎癥反應(yīng)的標(biāo)志分子。大量研究表明，CRP與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-7]。CRP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC）的損傷主要存在以下幾個(gè)方面：（1）激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，進(jìn)而攻擊內(nèi)膜；（2）促進(jìn)EC釋放內(nèi)皮素及IL-6；（3）下調(diào)一氧化氮合酶的mRNA和蛋白的表達(dá)，從而抑制一氧化氮的表達(dá)與合成；（4）誘導(dǎo)細(xì)胞粘附因子的表達(dá)和釋放，從而誘導(dǎo)單核免疫細(xì)胞粘附聚集。筆者前期工作也報(bào)道了CRP誘導(dǎo)EC損傷的分子機(jī)制[8-10]。蛋白質(zhì)組學(xué)是一種較新較前沿的研究方法，具有系統(tǒng)性、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)[11-12]。本研究中，筆者首次采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度探討CRP損傷EC的分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究采用2D DIGE研究的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，方案見(jiàn)表1。

1.2 試劑和儀器 CRP購(gòu)買自Trichem Rsources及Calbiochem公司，CRP的透析參照筆者之前的文章進(jìn)行[10]。硫脲、賴氨酸、二甲基甲酰胺購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，尿素、CHAPS、玻璃板硅烷化劑、甘氨酸、低熔點(diǎn)瓊脂糖、固相IPG干膠條、IPG buffer、蛋白質(zhì)純化試劑盒Clean-up Kit、定量試劑盒Quant Kit、熒光標(biāo)記試劑盒[CyDye DIGE Flour （minimal Dye） Labelling Kit]、Deep purple熒光染料、三氟乙酸均購(gòu)自GE Healthcare公司，正丁醇為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品。乙腈購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，測(cè)序級(jí)胰酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司。IPGphor Ⅲ等電聚焦電泳儀，Ettan DALT Six System SDS垂直電泳儀，Typhoon Trio掃描儀、Ettan Picker、Ettan Digester、DeCyder V7.0 Software均為GE Healthcare公司產(chǎn)品。MALDI-ToF-ToF質(zhì)譜儀為美國(guó)Bruker Dalton公司生產(chǎn)。

1.3 HCAEC的培養(yǎng)及處理 人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC），購(gòu)買自Cell Applications公司，HCAEC的培養(yǎng)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本研究使用的HCAEC為第4代，實(shí)驗(yàn)處理細(xì)胞之前，改為含0.1% FBS且不含細(xì)胞因子的EGM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組為HCAEC用25 μg/mL CRP處理24 h。endprint

1.4 樣品處理 在4 ℃預(yù)冷Tris-buffered sucrose solution（10mM Tris，250mM sucrose）中洗滌細(xì)胞，重復(fù)3次去除殘余培養(yǎng)基。每個(gè)10 cm皿中加入Standard lysis buffer（7M Urea，2M Thiourea，30mM Tris，4% CHAPS，）300 μL，刮下細(xì)胞并充分裂解，超聲破碎。4 ℃，20000 g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。蛋白質(zhì)的純化和定量嚴(yán)格按照2D Clean-up Kit或2D Quant Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 2D DIGE 樣品的熒光標(biāo)記按照筆者已經(jīng)報(bào)道過(guò)的方法進(jìn)行操作[13-14]，簡(jiǎn)述如下：按照2D DIGE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在4 ℃條件下，每個(gè)樣品50 μg用400 pmol Cy2、Cy3或者Cy5 在冰浴、避光條件下標(biāo)記30 min，然后用Lysine solution終止反應(yīng)。第一向等電聚焦程序如下：30 V，12 h，step-n-hold；500 V，1 h，step-n-hold；1000 V，1 h，step-n-hold；10 000 V，10 h，step-n-hold；Total：90 000Vh。用DTT和IAA進(jìn)行兩步平衡后進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE凝膠為12.5%。

1.6 DIGE凝膠掃描和差異蛋白的獲取 在進(jìn)行2D DIGE分析膠電泳的同時(shí)，另外準(zhǔn)備2張制備膠（500 μg/膠），按照Deep Purple stain kit操作說(shuō)明進(jìn)行制備膠的熒光染色，用Typhoon Trio掃描儀進(jìn)行2D DIGE分析膠和Deep Purple制備膠的圖像采集，用DeCyder7.0軟件進(jìn)行分析，在Ettan Picker上獲取差異蛋白質(zhì)樣品。

1.7 蛋白質(zhì)鑒定 獲取的目的蛋白斑點(diǎn)在Ettan Digester上進(jìn)行酶解。之后在MALDI-ToF-ToF質(zhì)譜儀上進(jìn)行蛋白鑒定，Mascot進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果

2.1 CRP刺激EC的2D DIGE差異分析 本研究按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)操作共獲得4張2D DIGE凝膠，每張2D DIGE凝膠經(jīng)過(guò)三種不同波長(zhǎng)的激光掃描后，可以得到3個(gè)分別由Cy2、Cy3和Cy5熒光標(biāo)記的不同處理的樣品圖像及合并（merge）的膠內(nèi)差異凝膠圖像（圖1顯示其中一張分析膠）。通過(guò)DeCyder7.0軟件的自動(dòng)匹配和隨后的人工核對(duì)，檢測(cè)到（2231±389）個(gè)蛋白斑點(diǎn)，不同處理組間的匹配率都接近80%，符合分析的標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過(guò)仔細(xì)分析，共發(fā)現(xiàn)差異大于1.5倍的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)11個(gè)，其中CRP處理組上調(diào)9個(gè)（斑點(diǎn)926、951、959、1921、1972、1989、1993、1994和1996），下調(diào)的斑點(diǎn)2個(gè)（1793和1889），見(jiàn)圖1。

2.2 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 接著對(duì)此11個(gè)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定，其中有6個(gè)斑點(diǎn)獲得了較好的譜圖，經(jīng)Mascot檢索成功鑒定出4個(gè)蛋白質(zhì)（其中斑點(diǎn)926與951為同一個(gè)蛋白，斑點(diǎn)1993與1994為同一個(gè)蛋白質(zhì)），鑒定出來(lái)的差異表達(dá)蛋白見(jiàn)表2。

2.3 CRP誘導(dǎo)表達(dá)差異的蛋白 CRP誘導(dǎo)EC上調(diào)表達(dá)的蛋白有HSPA8（Heat shock cognate 71 kDa protein）（圖2A）和PSME1（Proteasome activator complex subunit 1）（圖2B）。HSPA8是熱應(yīng)急蛋白質(zhì)HSP70家族的一員。而PSME1屬于蛋白降解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)。該發(fā)現(xiàn)提示，CRP可能一方面促使EC應(yīng)激，另外一方面促進(jìn)異常蛋白質(zhì)的降解。蛋白EEF1B2（Elongation factor 1-beta）為本研究發(fā)現(xiàn)的CRP誘導(dǎo)EC表達(dá)下調(diào)的蛋白（圖2C），EEF1B2的主要功能是參與蛋白質(zhì)的翻譯延長(zhǎng)過(guò)程。該結(jié)果提示，CRP可能通過(guò)下調(diào)表達(dá)EEF1B2而抑制蛋白質(zhì)的翻譯。

3 討論

2D DIGE引入了內(nèi)標(biāo)的概念，最大限度的消除了凝膠之間實(shí)驗(yàn)誤差引起的差異，因此2D DIGE檢測(cè)的蛋白質(zhì)差異數(shù)據(jù)更精確、更可靠。其次，2D DIGE采用熒光標(biāo)記的方法，與傳統(tǒng)的后染色雙向電泳比較很大程度上提高了檢測(cè)靈敏度，使得檢測(cè)到的可能的差異蛋白質(zhì)數(shù)量增加。本研究每張凝膠平均檢測(cè)到2231個(gè)蛋白斑點(diǎn)，而且凝膠之間匹配率都接近80%，說(shuō)明靈敏度和精確度還是比較好的。

CRP（C-reactive protein，CRP）主要功能是調(diào)理感染，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，參與細(xì)胞的凋亡。大量的研究表明，CRP能夠活化內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC）和損傷內(nèi)皮功能[15]，而且降壓藥物有較明顯的保護(hù)性干預(yù)作用[16]。Turu等[17]用TaqMan Low-density Arrays的方法鑒定出與CRP損傷EC相關(guān)的基因6個(gè)，有關(guān)學(xué)者則用芯片分析的方法發(fā)現(xiàn)CRP誘導(dǎo)EC的11個(gè)基因表達(dá)差異[12]。本研究采用2D DIGE結(jié)合MALDI-ToF-ToF的方法從蛋白質(zhì)組學(xué)研究的角度探索CRP損傷EC的可能分子機(jī)制，篩選鑒定出4個(gè)差異表達(dá)蛋白。

HSPA8是熱應(yīng)急蛋白質(zhì)HSP70家族的一員，熱休克蛋白是細(xì)胞內(nèi)古老的分子之一，是一種保護(hù)性的蛋白質(zhì)。也是一種常見(jiàn)的分子伴侶。受到外界刺激時(shí)，熱休克蛋白被大量合成，幫助細(xì)胞來(lái)維持正常的生理活動(dòng)，阻止蛋白質(zhì)的相互作用和聚集。此外，HSPA8還是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活的抑制子，發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄的功能[18]。CRP刺激EC細(xì)胞造成應(yīng)激，誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)上調(diào)，可能發(fā)揮代償性保護(hù)細(xì)胞的作用。PSME1屬于蛋白降解系統(tǒng)[19]，CRP刺激EC時(shí)誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)。CRP一方面促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，另外一方面可能促進(jìn)異常蛋白質(zhì)的降解。EEF1B2的主要功能是作為鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子參與蛋白質(zhì)的翻譯延長(zhǎng)過(guò)程[20]，CRP可能通過(guò)下調(diào)表達(dá)EEF1B2進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的翻譯。endprint

值得注意的是，斑點(diǎn)1993和1994在CRP處理組表達(dá)明顯上升，而這兩個(gè)斑點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定恰恰就是CRP本身。這說(shuō)明雖然在本研究中，裂解蛋白之前使用Tris-buffered sucrose solution對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了3次洗滌，但是并沒(méi)有完全清除掉CRP蛋白本身，處理組存在CRP遺留下來(lái)的“蛋白污染”。一個(gè)重要的可能原因是：CRP與其EC上的受體CD32、CD64結(jié)合緊密有關(guān)[1-3]。

CRP對(duì)EC的損傷作用是比較明確的，但是本研究發(fā)現(xiàn)的差異蛋白比實(shí)驗(yàn)前預(yù)計(jì)的少，只有11個(gè)。其中一個(gè)可能的原因是，刺激EC的CRP濃度偏低（25 μg/mL），一般認(rèn)為中位濃度為50 μg/mL[3]。另外一個(gè)可能的原因是，目前對(duì)于CRP損傷EC的作用大多報(bào)道的是信號(hào)通路分子，比如蛋白激酶。而信號(hào)通路分子的蛋白豐度一般都比較低，以2D DIGE的靈敏度比較難檢測(cè)出來(lái)。

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（收稿日期：2017-03-16） （本文編輯：周亞杰）endprint