葉定興，徐一，毛麗萍，王大選，陳鵬飛，李丹，連特女，鄭美琴

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院檢驗科，浙江溫州 325000)

·案例分析·

膠孢炭疽菌性角膜潰瘍2例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

葉定興，徐一，毛麗萍，王大選，陳鵬飛，李丹，連特女，鄭美琴

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院檢驗科，浙江溫州 325000)

膠孢炭疽菌；炭疽菌；角膜潰瘍

炭疽菌(Colletotrichumspp)，異名刺盤孢屬，是常見的一類植物病原真菌[1]。膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是一種重要的炭疽菌，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶國家和地區(qū)，可以引起多種植物炭疽病，宿主包括橡膠、芒果、西瓜、香蕉、柱花草、桃等[2-3]。膠孢炭疽菌很少對人類產(chǎn)生感染,膠孢炭疽菌性角膜炎更是罕見。國內(nèi)尚未見類似報道，國外有一些病例報告[4-9]。本文報告膠孢炭疽菌引起角膜潰瘍2例。

1 病歷摘要

患者1，男性，67歲，2016年7月18日因“右眼細(xì)菌性角膜炎”曾在我院以妥布霉素滴眼液、頭孢他啶滴眼液、加替沙星眼用凝膠頻點右眼局部抗感染治療，效果不佳，后行“右眼穿透性角膜移植術(shù)”，恢復(fù)可，出院后繼續(xù)使用妥布霉素抗感染治療。后因“右眼角膜發(fā)白2 d”于2016年11月1日擬“右眼感染性角膜炎”收治入院。入院后?？茩z查：右眼光感。眼壓：右眼指測正常。右眼眼瞼閉合不全，結(jié)膜充血，全角膜植片變白、溶解，前房積膿約1/2，病灶匍行在角膜內(nèi)皮面，余窺視不清(圖1A)。微生物檢查：依據(jù)《感染性眼病細(xì)菌學(xué)檢查操作專家共識》(2015)[10]于2016年11月1日刮取角膜潰瘍基底部組織，即時接種至巧克力平板、PDA平板并涂片。涂片用快速革蘭染液(BASO公司)染色后鏡下找到真菌菌絲，未找到細(xì)菌，同日行角膜共聚焦顯微鏡檢查提示上方角膜可見真菌菌絲。在PDA平板30 ℃培養(yǎng)2 d后長出真菌，菌落白色，3 d后菌落出現(xiàn)斑點狀褐色，培養(yǎng)時間越長顏色越深，見圖2。并作膠帶法粘取菌落用棉藍(lán)染液(BASO公司)染色并鏡下觀察，可見分生孢子圓柱形，兩端鈍圓，單胞，孢子量少，大量菌絲。為更好觀察孢子生長情況，將菌落接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(美華醫(yī)療公司)30 ℃培養(yǎng)5 d，直接乳酸酚棉藍(lán)染液染色鏡檢，見圖3A。同時將菌落分純至另一PDA平板送杭州金域醫(yī)學(xué)檢驗所作靶向DNA測序。2016年11月18日靶向DNA測序結(jié)果：序列與Colletotrichumgloeosporioides、Colletotrichumfructicola和Colletotrichumignotum相似度最高，均為100%。結(jié)合鏡下孢子形態(tài),診斷該菌為Colletotrichumgloeosporioides。采用康泰生物真菌藥敏試條E-test法進(jìn)行藥敏試驗，最低抑菌濃度(MIC)值結(jié)果為：兩性霉素B 0.064 μg/mL、伊曲康唑0.25 μg/mL、伏立康唑0.064 μg/mL。患者入院后予以兩性霉素滴眼液、那他霉素滴眼液點右眼，口服伊曲康唑，病情控制不佳，右眼感染性角膜炎進(jìn)展較快，且右眼眼瞼閉合不全，再次行右眼角膜移植術(shù)風(fēng)險較大且預(yù)后不佳，于2016年11月3日靶控聯(lián)合麻醉下行“右眼眼內(nèi)容物摘除并結(jié)膜成形術(shù)”，患者術(shù)后5 d恢復(fù)可、無需特殊住院治療，予帶藥出院。

患者2，男性，53歲，因“右眼被板栗刺擊傷后視物不清2個月”于2016年12月17日擬“右眼全眼球炎(真菌性？)，右眼角鞏膜異物取出術(shù)后”收治入院。專科檢查：裸眼視力右眼指數(shù)10 cm，眼壓：雙眼眼壓指測正常。右眼結(jié)膜混合充血，顳下方見一針結(jié)膜縫線，鼻下方角膜可見一針尖樣白色混濁灶，內(nèi)皮見少許角膜后沉著物，前房深度可，病灶匍行在晶狀體前表面，下方見少量白色積膿(圖1B)，晶狀體混濁，玻璃體及眼底窺不入。微生物檢查：入院當(dāng)日行角膜刮片涂片及培養(yǎng)，涂片革蘭染色未找到細(xì)菌和真菌，真菌培養(yǎng)7 d陰性，臨床結(jié)合病史、體征及輔助檢查，以真菌性角膜炎收治，予伊曲康唑膠囊、兩性霉素滴眼液、那他霉素滴眼液抗真菌治療，左氧氟沙星滴眼液等抗炎、預(yù)防感染治療，病情未見好轉(zhuǎn)。于2016年12月19日球后阻滯麻醉下急診行“右眼白內(nèi)障超聲乳化吸除并玻璃體切除并氣液交換并硅油填充并玻璃體腔注藥(伏立康唑)術(shù)”，并即時將玻璃體液接種培養(yǎng)及涂片，涂片革蘭染色未找到細(xì)菌和真菌，30 ℃培養(yǎng)2 d后玻璃體真菌培養(yǎng)基(實驗室自配)長出真菌，菌落白色，做點種分純接種至PDA平板，3 d后菌落出現(xiàn)斑點狀褐色，并作膠帶法粘取菌落行乳酸酚棉藍(lán)染色鏡下觀察形態(tài)，分生孢子圓柱形，兩端鈍圓，單胞，孢子量可，見大量菌絲，見圖3B。采用康泰生物真菌藥敏試條進(jìn)行E-test法藥敏試驗，MIC值結(jié)果：兩性霉素B 0.25 μg/mL、伊曲康唑>32 μg/mL、伏立康唑0.125 μg/mL。于2017年5月4日送杭州金域醫(yī)學(xué)檢驗所作靶向DNA測序，結(jié)果為序列與Colletotrichumgloeosporioides和Colletotrichumviniferum相似度最高，均為100%。結(jié)合鏡下孢子形態(tài),診斷該菌為Colletotrichumgloeosporioides。術(shù)后7 d病情穩(wěn)定，予帶藥出院。患者3月后在我院行“右眼硅油取出并眼底探查并人工晶體懸吊并角膜縫線拆除術(shù)”，術(shù)后患者恢復(fù)良好，右眼視力0.3。

注：A，全角膜植片變白、溶解，前房積膿約1/2，病灶匍行在角膜內(nèi)皮面；B，右眼結(jié)膜混合充血，鼻下方角膜可見一針尖樣白色混濁灶，內(nèi)皮見少許角膜后沉著物，前房深度可，下方見少量白色積膿。

圖1 入院時感染部位

注：A，培養(yǎng)5 d；B，培養(yǎng)7 d。

圖2 病例1角膜潰瘍基底部組織PDA平板30 ℃培養(yǎng)生長的菌落形態(tài)

注：A，病例1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)30 ℃培養(yǎng)5 d直接乳酸酚棉藍(lán)染色；B，病例2 PDA平板30 ℃培養(yǎng)5 d膠帶紙法取菌落乳酸酚棉藍(lán)染液染色。

圖3 分生孢子形態(tài)(×400)

2 討論

膠孢炭疽菌菌落初白色，后產(chǎn)生分生孢子盤。分生孢子盤褐色至深褐色，未見剛毛；分生孢子梗細(xì)長柱形、長筒形，無色，無隔膜，(15～20.5) μm×(4.5～6.0)μm；產(chǎn)孢細(xì)胞圓柱形，無色，光滑，內(nèi)壁芽生瓶梗式產(chǎn)孢；分生孢子圓柱形，兩端鈍圓，單胞，分生孢子大小為(8.7～20.9)μm×(3.48～4.78)μm。有性態(tài)為圍小叢殼菌[Glomerellacingulata(Stonem.)Spauld.etSchrenk]，子囊殼密集，深褐色，有喙，球形；子囊棍棒形，簇生在細(xì)長的子囊梗上，大小為(50～80) μm×(8.70～15.23)μm，內(nèi)含8個子囊孢子，壁可消解；子囊孢子單胞，無色，稍彎曲，大小為(12.2～22.8) μm×(3.5～5.12)μm[11]。本報道2例菌落初為白色，培養(yǎng)3 d即可見褐色，培養(yǎng)時間越長褐色越深，分生孢子圓柱形，兩端鈍圓，大小約10.19 μm×4.70 μm，形態(tài)均符合以上特征。

目前真菌性角膜炎主要依據(jù)臨床特點、涂片、培養(yǎng)、共聚焦顯微鏡檢查、病理學(xué)檢查等來診斷，其中涂片與培養(yǎng)在臨床應(yīng)用中最為多見，目前真菌病的診斷大部分還是僅依據(jù)形態(tài)特征。有文獻(xiàn)報道1例巴西皮下真菌感染患者，僅根據(jù)形態(tài)學(xué)特征診斷為殼皮炭疽菌，最后被證實為膠孢炭疽菌，這兩類菌在分生孢子形態(tài)上僅存在大小差異，需要依據(jù)分子測序技術(shù)區(qū)分[12]。本報道2例采用革蘭染色方法對涂片和培養(yǎng)陽性的真菌標(biāo)本進(jìn)行染色，依據(jù)菌落的形態(tài)特征及鏡下菌絲形態(tài)，孢子大小、形狀等特征進(jìn)行初步判斷，再結(jié)合靶向DNA測序技術(shù)作出診斷。

目前，該菌對多菌靈、甲基托布津、苯菌靈等苯并咪唑類藥劑產(chǎn)生抗藥性的情況已經(jīng)引起廣泛關(guān)注[13]。膠孢炭疽菌性角膜炎患者多有接觸植物的外傷史，且可以用抗真菌藥物治愈，所有的分離株在25 ℃生長良好，但在35、37 ℃生長不佳，有類似的藥物敏感性資料：對兩性霉素B、伊曲康唑、咪康唑、米卡芬凈、伏立康唑敏感，對氟胞嘧啶，氟康唑，那他霉素相對耐藥[14]。由于缺乏數(shù)據(jù)支持，該菌對敏感的抗真菌藥是否會產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象還有待考究。本報道2例都對兩性霉素B和伏立康唑表現(xiàn)出較高的MIC。Llamos等[9]報道2例免疫功能正常且無外傷史的炭疽菌感染的角膜炎，并且使用局部抗真菌藥物治療效果不佳，需要使用穿透性角膜移植術(shù)治療。病例1患者為角膜移植術(shù)后暴露性感染，無外傷史，病例2患者有外傷史。病例1患者由于早期未發(fā)現(xiàn)真菌感染證據(jù)，未使用抗真菌藥物，后期病情進(jìn)展嚴(yán)重，預(yù)后不佳，眼球內(nèi)容物摘除；病例2患者病情同樣進(jìn)展很快，但在缺乏實驗室輔助診斷真菌感染證據(jù)下，及時使用手術(shù)及玻璃體腔內(nèi)注射抗真菌藥物治療，臨床效果顯著，預(yù)后良好，繼續(xù)隨訪。本報道2例局部抗真菌治療效果不佳，是否由于病灶均在角膜內(nèi)皮面而影響表面局部抗真菌用藥的療效，還需進(jìn)一步查證。目前，真菌感染的確診仍有賴于實驗室病原菌的分離和培養(yǎng)，早期發(fā)現(xiàn)真菌菌絲或培養(yǎng)真菌陽性對指導(dǎo)用藥非常重要，再加上真菌感染有典型的臨床癥狀，所以經(jīng)驗性抗真菌治療往往也是必需的。

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2017-05-24)

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.13

葉定興，1990年生，男，技師，大學(xué)本科，從事微生物檢驗工作。

鄭美琴，主任技師，碩士，E-mail：zmqlyllh@126.com。

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