張 黎， 張?zhí)旆?，萬(wàn) 惠，司 熙*

(1.海南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院,海南 ?？?711012;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

Th17/Treg細(xì)胞在各型慢性牙周炎中含量的比較分析

張 黎1， 張?zhí)旆?，萬(wàn) 惠1，司 熙1*

(1.海南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院,海南 ?？?711012;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)為最常見(jiàn)的一型牙周炎，約占牙周炎患者的95%。慢性牙周炎CP 可發(fā)生于任何年齡，但大多患者為成年人，35 歲后患病率明顯升高，慢性牙周炎是一種多因素疾病，宿主的免疫調(diào)節(jié)在慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，機(jī)體免疫系統(tǒng)在防御病原微生物的同時(shí)會(huì)對(duì)牙周組織產(chǎn)生病理破壞作用。曾有學(xué)者用 Th1/Th2 理論來(lái)解釋從牙齦炎到牙周炎的發(fā)展過(guò)程[1，2]，但近些年來(lái)的研究表明，Th1/Th2 模型對(duì)牙周炎發(fā)病機(jī)制的闡述具有明顯的局限性，許多由 T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)并不能完全用Th1/Th2 模型來(lái)解釋[3]，而輔助性 T 細(xì)胞 17(T helper cell 17,Th17)和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(regulation T cells,Treg)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)有助于解釋一些經(jīng)典的 Th1/Th2 模型存在的缺陷。Th17/Treg 的失衡在牙周炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[4，5]Th17 和 Treg 在炎癥和自身免疫病中的作用相互拮抗，這一觀點(diǎn)已經(jīng)被大多數(shù)學(xué)者接受。Th17 可以促進(jìn)炎癥和自身免疫，而 Treg 對(duì)炎癥和自身免疫則有抑制作用，在自身耐受和免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。Th17 細(xì)胞是近期發(fā)現(xiàn)的一類(lèi) CD4+T 細(xì)胞亞群，因其可產(chǎn)生白細(xì)胞介素(interleukin，IL-17)而被命名，在宿主抵御胞外菌和真菌感染時(shí)發(fā)揮作用。目前已經(jīng)證明，Th17 細(xì)胞和其分泌的 IL-17在許多炎癥性疾病和自身免疫病中起重要作用。Treg 細(xì)胞屬于 CD4+T 細(xì)胞亞群，又被稱(chēng)為“抑制細(xì)胞” ，在自身免疫、抗感染免疫以及抗腫瘤免疫中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Treg 細(xì)胞的功能包括抑制自身免疫、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答以防止炎癥損傷。Treg 細(xì)胞與Th17細(xì)胞一樣，均由 TGF-β 誘導(dǎo)產(chǎn)生。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)能精確有效的檢測(cè)出淋巴細(xì)胞亞群中Treg 細(xì)胞與Th17細(xì)胞表達(dá)的情況。

1 材料與方法

1.1主要試劑

Th17/Treg流式分析用試劑 CD4-BB515、IL-17A-PE、IL-17A-PE同型、CD4-FITC、CD25-APC、CD25-APC同型、CD127-PE、CD127-PE同型、紅細(xì)胞裂解液、Stain Buffer(FBS)、固定破膜液、刺激劑+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制劑，美國(guó)BD公司。

1.2主要設(shè)備

流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD公司;臺(tái)式離心機(jī),美國(guó)Thermo公司;恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱,德國(guó)Heraeus公司;肝素納抗凝真空采血管,美國(guó)BD公司。

1.3病例選擇

選擇2015.1—2015.6來(lái)我院就診的 45例慢性牙周炎患者，男性22例，女性23例，年齡22-67 歲，平 均 (30.25±6.51 )歲，均 符合 以 下 標(biāo)準(zhǔn)[1]:(1)全身健康無(wú)系統(tǒng)病史；(2)近1年內(nèi)無(wú)牙周治療史；(3)近3個(gè)月無(wú)服藥史；(4)至少余留20顆牙；(5)中、重度的牙周炎，多個(gè)位點(diǎn)探診深度 (PD)≥5 mm，X線片顯示骨喪失。院外均未使用抗生素、激素及免疫類(lèi)藥物，半個(gè)月內(nèi)未行牙周治療，不伴有系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病及妊娠、哺乳期婦女，術(shù)前心電圖、心肺功能及肝腎功能檢查均正常，排除有高血壓、惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病病史者。正常對(duì)照組18 例，男性 10 例，女性8例，年齡 20-69歲，平均(32.13±7.19)歲，均為正常體檢者，兩組一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均gt;0.05)，具有可比性。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組按照慢性牙周炎的病變程度分為四組：重度牙周炎組、中度牙周炎、輕度牙周炎組、牙周健康組(正常對(duì)照組)。前3組每組15例，對(duì)照組18例，分別抽取外周血。

1.4.1正常對(duì)照組的診斷標(biāo)準(zhǔn)：探診無(wú)出血，全口牙的 探診深度≤3 mm，無(wú)附著喪失，無(wú)牙槽骨吸收，無(wú)牙齦退縮。

1.4.2慢性牙周炎輕度組的診斷標(biāo)準(zhǔn):牙齦有炎癥和探診出血，牙周袋≤4 mm，附著喪失1-2 mm，X線片顯示牙槽骨吸收不超過(guò)根長(zhǎng)的1/3,可有或無(wú)口臭。

1.4.3慢性牙周炎中度組的診斷標(biāo)準(zhǔn):牙齦有炎癥和探診出血，也可有膿，牙周袋≤6 mm，附著喪失3-4 mm，X線片顯示牙槽骨吸收或角型吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1/3,但不超過(guò)根長(zhǎng)的1/2,牙可能有輕度松動(dòng)，多根牙的根分叉區(qū)可能有輕度病變。

1.4.4慢性牙周炎重度組的診斷標(biāo)準(zhǔn):牙齦炎癥較明顯或可發(fā)生牙周膿腫，牙周袋gt;6 mm，附著喪失gt;5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1/2,多根牙有根分叉病變，牙多有松動(dòng)[6]。

1.5方法

1.5.2流式細(xì)胞術(shù)分選Treg 細(xì)胞 ①肝素鈉真空抗凝采血管取人外周血全血1-2 ml，血液室溫放置，8 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，否則需棄用。②取7個(gè)流式管，分別標(biāo)記空白管、CD4 抗體單染管、CD25 抗體單染管、CD25 同型對(duì)照抗體管、CD127 抗體單染管、CD127 同型對(duì)照抗體管、待測(cè)管，每個(gè)流式管分別加入100 μl 全血。③細(xì)胞表面標(biāo)記染色：向CD4 抗體單染管、CD25 同型對(duì)照抗體管、CD127 同型對(duì)照抗體管、待測(cè)管分別加入1 Test 體積的CD4 抗體。向CD25 抗體單染管、CD127同型對(duì)照抗體管、待測(cè)管分別加入1 Test 體積的CD25 抗體。向CD25 同型對(duì)照抗體管加入1 Test 體積的CD25的同型對(duì)照抗體。向CD127 同型對(duì)照抗體管加入1 Test 體積的CD127 的同型對(duì)照抗體。向CD127 抗體單染管、待測(cè)管分別加入1 Test 體積的CD127 的抗體。加入抗體以后渦旋細(xì)胞3 s，并室溫避光孵育30 min。④制備紅細(xì)胞裂解液：制備1X.紅細(xì)胞裂解液(BD Lysing Buffer 10X，貨號(hào)555899)，取10X 紅細(xì)胞裂解液，按照體積1(10X 紅細(xì)胞裂解液)：9(dH2O)，稀釋。⑤每100 μl 全血加入2 ml 1X 紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解15-30 min，至細(xì)胞懸液呈澄清透明狀。⑥裂紅后，500 g，離心5 min，洗滌細(xì)胞，離心后棄上清。⑦加入1 ml FBS(貨號(hào)554656)，500 g，離心5 min，洗滌細(xì)胞，離心后棄上清。⑧加入350 μl FBS(貨號(hào)554656)重懸細(xì)胞，上流式儀器進(jìn)行分選。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件處理，數(shù)據(jù)均以M±SD表示。組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；各組兩兩比較為q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

重度慢性牙周炎的Treg細(xì)胞/CD4細(xì)胞比值為5.6%明顯高于健康對(duì)照組的4.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

中度慢性牙周炎Treg細(xì)胞/CD4細(xì)胞比值為4.2%略低于健康對(duì)照組的4.7%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

輕度慢性牙周炎 Treg細(xì)胞/CD4細(xì)胞比值為4.6%接近健康對(duì)照組的4.7%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

各組間比較：輕中慢性牙周炎差異不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；輕中慢性牙周炎與重度慢性牙周炎差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

重度慢性牙周炎的Th17細(xì)胞/CD4細(xì)胞比值為2.5%明顯高于健康對(duì)照組的1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；中度慢性牙周炎Th17細(xì)胞/CD4細(xì)胞比值為1.3%略高于健康對(duì)照組的1%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；輕度慢性牙周炎Th17細(xì)胞/CD4細(xì)胞比值為1.4%略高于健康對(duì)照組的1%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。輕中度慢性牙周炎之間比較差異不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；輕中度慢性牙周炎與重度慢性牙周炎比較差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

各組血清中Treg及Th17細(xì)胞含量比較見(jiàn)表1，2。

表1 各組血清中 Treg細(xì)胞含量比較

注：與對(duì)照組比較，①Plt;0.05；與輕中度慢性牙周炎比較②Plt;0.05。

表2 各組血清中Th17細(xì)胞含量的檢測(cè)結(jié)果比較

注：與對(duì)照組比較，①Plt;0.05；與輕中度慢性牙周炎比較②Plt;0.05。

3 討論

慢性牙周炎是發(fā)生在牙齦、牙周膜和牙槽骨等牙齒支持組織的一種常見(jiàn)的口腔感染性疾病,確切的發(fā)病機(jī)制仍未明了。然而牙周膜相關(guān)的微生物觸發(fā)宿主免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致牙齒支持組織進(jìn)行性喪失為慢性牙周炎發(fā)生的主要原因之一。CD4+T 細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答的一類(lèi)重要細(xì)胞，在不同的微環(huán)境及細(xì)胞因子作用下可以分化成多種亞型，其中的Th17 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞( Tregulatory cells，Treg) 在分化發(fā)育過(guò)程中受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控，參與宿主的免疫應(yīng)答，發(fā)揮促進(jìn)或抑制炎癥反應(yīng)的作用，均與牙周骨破壞有關(guān)[7]，是近年來(lái)有關(guān)慢性牙周炎免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)慢性牙周炎患者外周血中的Th17和 Treg細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)作為檢測(cè)手段，比較各型慢性牙周炎與牙周健康的對(duì)照組人群外周血中Th細(xì)胞亞群中的Terg ,Th17表達(dá)水平。我們的結(jié)果顯示牙周炎病人外周血中Terg ,Th17細(xì)胞比例升高，提示Terg,Th17介導(dǎo)的細(xì)胞免疫可能參與牙周炎的全身系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，并且推測(cè)兩者在外周血中高表達(dá)的水平與牙周炎發(fā)病關(guān)系密切。隨著慢性牙周炎病變程度的不同，Terg與Thl7的差異亦呈現(xiàn)顯著變化。重度慢性牙周炎組Terg,Th17在CD4+淋巴細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組。中度慢性牙周炎Terg在CD4+淋巴細(xì)胞比例略低于健康對(duì)照組，可能由于采血前病人進(jìn)行過(guò)刮治影響了結(jié)果；輕度慢性牙周炎Terg在CD4+淋巴細(xì)胞比例接近于健康對(duì)照組；輕中度慢性牙周炎Th17細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比例略高于健康對(duì)照組，但差異不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間相比較重度牙周炎Terg,Th17細(xì)胞在CD4+淋巴細(xì)胞比例明顯高于輕中度牙周炎，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Th17 細(xì)胞是近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的機(jī)體內(nèi)存在的一種新型的輔助性 T 細(xì)胞亞群，因其可以分泌 IL-17，故被稱(chēng)為 Th17 細(xì)胞。該細(xì)胞是由 Th0 細(xì)胞分化的，具有獨(dú)立的分化發(fā)育和調(diào)節(jié)機(jī)制。Th17 細(xì)胞介導(dǎo)炎性反應(yīng)[10]，在自身免疫或免疫應(yīng)答引起的組織破壞的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用[11-13]，并參與腫瘤和移植物抗宿主等疾病的發(fā)生和發(fā)展，決定疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后[14,8]。Treg 在慢性持續(xù)感染中發(fā)揮免疫抑制作用[15]。Treg 的免疫抑制作用雖然削弱了免疫系統(tǒng)的抗感染作用，但也避免了過(guò)度免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生的病理?yè)p害。Cardoso 通過(guò)免疫組化方法發(fā)現(xiàn)牙周健康者、牙齦炎和牙周炎的牙齦組織中均有 Treg 和其細(xì)胞因子 IL-10、TGF-β 的表達(dá)，且在牙周炎組織中的表達(dá)顯著增高[9]。

牙菌斑生物膜是牙周炎發(fā)生的始動(dòng)因子,堆積在牙頸部和齦溝內(nèi)的牙菌斑微生物及其毒性產(chǎn)物會(huì)刺激牙周組織導(dǎo)致牙周組織的破壞，并激活機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，毒性產(chǎn)物及其引發(fā)的炎性介質(zhì)可以進(jìn)入血液循環(huán)，牙周炎的進(jìn)展及病變程度主要取決于宿主的免疫反應(yīng)[16]。T 細(xì)胞是機(jī)體抗炎免疫應(yīng)答中重要的反應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，研究表明，T 細(xì)胞與牙槽骨吸收及牙周炎的預(yù)后密切相關(guān)，活化 CD4 T 細(xì)胞產(chǎn)生的相關(guān)因子能夠影響牙周炎的病理性破骨細(xì)胞激活與分化[17]。健康的組織中存在 Th17/Treg細(xì)胞的平衡，Th17/Treg 細(xì)胞的失衡會(huì)導(dǎo)致破壞性的免疫反應(yīng)[18]Th17 細(xì)胞和 Treg細(xì)胞在免疫應(yīng)答中起相反作用[19]。促炎性Th17細(xì)胞與抑制性Treg細(xì)胞的失衡在炎癥及自身免疫病中是一個(gè)關(guān)鍵因素。在多種炎癥中檢測(cè)到 Th17 和Treg 的不同表達(dá)，認(rèn)為 Th17和 Treg 對(duì)炎癥的發(fā)展起到重要的作用。Treg/Th17 和其所產(chǎn)生的細(xì)胞因子相互作用形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。Ohlrich[2]等認(rèn)為，Th17/Treg 失衡引起的自身免疫反應(yīng)是造成牙周炎發(fā)生發(fā)展的因素之一。

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1.海南省自然科學(xué)基金(20158318)；2.海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金(HY2014-009)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1965-04

2017-01-17)