金艷玲，王 英，陳 悅，許文晶，胡 萍，徐韶琳

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

甲酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜光感受器細胞自噬

金艷玲，王 英，陳 悅，許文晶，胡 萍，徐韶琳*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

目的近些年來，發(fā)生過很多因飲用假酒致甲醇中毒的事件。本研究旨在探討甲酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜光感受器細胞 (661W細胞) 損傷過程中對細胞自噬水平的影響。方法將15和30 mM濃度的甲酸鈉分別加入661W細胞培養(yǎng)基作用24 h 后，用MDC熒光染色來檢測細胞自噬水平改變，透射電鏡觀察661W細胞自噬體的形成， Western blotting 法檢測LC3、 p-mTOR 、Beclin 1 及JNK、p-JNK蛋白的表達，流式細胞儀分析檢測細胞內(nèi)活性氧的變化。結(jié)果與對照組比較，15或30 mM甲酸鈉處理661W細胞后，熒光顯微鏡下觀察到細胞自噬水平增強，透射電鏡下觀察到自噬體形成，Western blotting 法顯示LC3-II ，Beclin 1以及pJNK的蛋白表達水平上調(diào)，而p-mTOR 的蛋白表達水平減少，流式細胞儀檢測法顯示甲酸鈉處理的661W細胞內(nèi)活性氧水平增加。結(jié)論甲酸鈉可誘導(dǎo)661W細胞自噬，而自噬可能參與假酒中毒所致的視覺損傷過程。

甲醇中毒；甲酸鈉；自噬；661W細胞；活性氧

(ChinJLabDiagn,2017,21:1995)

背景 近些年來，發(fā)生過很多因飲用假酒致甲醇中毒的事件。甲醇是一種揮發(fā)性液體,易溶于水和體液中,雖然甲醇本身不是一種毒素，但其代謝物有毒，可能引起視力損害、大腦及心血管損傷甚至死亡[1，2]。

甲醇可在脫氫酶的作用下先后轉(zhuǎn)化為甲醛和甲酸,二者的毒性作用遠大于甲醇的毒性作用，可誘導(dǎo)細胞線粒體功能障礙，抑制細胞色素氧化酶活性，抑制視網(wǎng)膜氧化磷酸化的過程,影響ATP的合成，從而引起細胞退行性病變，甚至導(dǎo)致細胞死亡[3]。而大腦和視網(wǎng)膜作為高代謝器官極易因ATP的減少受到影響。

自噬( autophagy)是細胞自身的一種分解代謝過程，被認為是除了凋亡和壞死以外的第三種細胞死亡模式[4]。自噬表現(xiàn)為細胞降解多余或衰亡的細胞器及損傷蛋白的現(xiàn)象，生命體以此維持蛋白代謝平衡及細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，細胞內(nèi)過度自噬或自噬不足都會引起細胞損傷，并與某些疾病的發(fā)生相關(guān)[5,6]。

本研究旨在研究甲酸鈉暴露于661W細胞對細胞自噬水平的影響，進一步探討甲醇中毒所致的細胞自噬性死亡的分子機制。為研究甲醇中毒引起視覺損傷的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1抗體和反應(yīng)物

cJun Nterminal kinase(JNK)， (p)JNK， LC3，Beclin-1和mTOR的抗體購買于美國Cell Signaling Technology公司。GAPDH購買于上海康晨生物技術(shù)公司。所有主要的抗體稀釋1∶1,000。山羊第二抗體由英國Thermo Fisher Scientific公司制得，超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECLPlus kit)購買于上海碧云天公司。甲酸鈉購置于上?；瘜W(xué)試劑國藥控股有限公司。MDC， DCFHDA，購自美國SigmaAldrich公司。

1.2細胞培養(yǎng)

661W細胞(ATCC細胞庫)培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清，100 g/ml的鏈霉素， 100 u/ml的青霉素培養(yǎng)液。置于37℃、含有95%的空氣及5%的CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合達到80%進行傳代。每3-4 d應(yīng)用胰蛋白酶消化傳代1次。

1.3MDC染色

MDC可使自噬小體染色顯像。用不同濃度的甲酸鈉(15或30 mM) 常規(guī)處理661W細胞6 h。再用0.1 mM濃度的 MDC孵化30 min。用熒光顯微鏡下觀察熒光圖像。

1.4透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)

用兩種不同濃度的甲酸鈉(15或30 mM) 常規(guī)處理661W細胞24 h，收集細胞、離心，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌2次，離心、棄緩沖液，然后加入預(yù)冷的1% 餓酸固定，重懸，置于4℃冰箱固定4-6小時后送樣觀察。

1.5Westernblotting檢測蛋白

在常規(guī)培養(yǎng)24 h后的661W細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度(0，15，30 mM)的甲酸鈉，孵育24 h。收集細胞于3 000 r/min離心5 min，加入裂解液于冰上裂解30-45 min，細胞溶解產(chǎn)物于4℃、12 000 r/min離心5 min。在上清液中加入1/4容積的4×SDS樣本液后煮沸5 min。SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至聚二氟乙烯膜上，用含有5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入稀釋的一抗(1∶1000)，于4℃過夜孵育。用TBST洗滌膜3次后，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育30 min。充分洗滌后，用ECL液化學(xué)發(fā)光方法檢測蛋白。

1.6活性氧(ROS)檢測

細胞內(nèi)活性氧(ROS)能夠氧化熒光探針DCFH-DA，產(chǎn)生熒光產(chǎn)品—2′,7′ -二氯熒光素(DCF)[7]。用濃度為0、15、和30 mM的甲酸鈉處理細胞24 h,去掉上清液,用PBS洗滌三次。收集細胞，離心，加入DCFH - DA(10 μM最終濃度)并充分混勻，在37℃下孵化15 min。最后,用流式細胞儀進行檢測。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件，通過對兩組間的t檢驗或多組間的方差分析檢測差異。數(shù)據(jù)用標準差表示。Plt;0.05表明統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1MDC熒光染色觀察細胞自噬

MDC可特異性地結(jié)合于細胞自噬囊泡內(nèi)，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)為綠色熒光顆粒，熒光強度與自噬囊泡數(shù)量成正相關(guān)，因此，可根據(jù)熒光顯微鏡下，細胞內(nèi)熒光顆粒的增加來評估細胞自噬的發(fā)生。如圖1所示，與對照組相比，經(jīng)過甲酸鈉處理的661W細胞，在經(jīng)MDC染色后，胞漿內(nèi)出現(xiàn)了明顯的綠色熒光顆粒,30 mM甲酸鈉處理組較15 mM甲酸鈉處理組綠色熒光顆粒增多，說明甲酸鈉能夠誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生。

2.2透射電鏡觀察661細胞自噬體的形成

如圖2，與對照組相比甲酸鈉處理的661W細胞內(nèi)自噬體形成，并且30 mM甲酸鈉處理組較15 mM甲酸鈉處理組自噬體形成較多。透射電鏡下觀察到，實驗組細胞內(nèi)見膜狀結(jié)構(gòu)包繞損傷細胞器或細胞溶質(zhì)形成的液泡狀結(jié)構(gòu)-自噬體。結(jié)果表明，甲酸鈉作用的661W細胞自噬水平增加。

2.3甲酸鈉作用于661W細胞后LC3II、Beclin-1、p-mTOR水平的變化

為了探討甲酸鈉是否誘導(dǎo)661W細胞自噬，Western blotting法檢測LC3、Beclin 1、p-mTOR的蛋白表達水平。與對照組相比，用15和30 mM濃度甲酸鈉處理的661W細胞LC3 - II及Beclin-1的蛋白表達水平顯著增加， p-mTOR表達水平下降(圖3)。在這一實驗中LC3I- I表達水平無顯著變化。這些結(jié)果表明,細胞自噬水平的增加，可能與甲酸鈉誘導(dǎo)661W細胞毒性作用相關(guān)。

圖1熒光顯微鏡觀察MDC染色后細胞內(nèi)自噬囊泡分布情況濃度為0(對照組),15和30mM甲酸鈉作用于661W細胞，經(jīng)MDC染色于熒光顯微鏡觀察。與對照組比較，15和30mM甲酸鈉作用的661W細胞產(chǎn)生綠色熒光顆粒增多。MDC熒光顆粒由箭頭表示。

圖2透射電鏡下觀察自噬體的形成661W細胞暴露在濃度為0(對照組),15和30mM甲酸鈉中培養(yǎng)，送樣觀察。與對照組相比，暴露在15和30mM甲酸鈉的661W細胞形成多個典型的膜結(jié)構(gòu)包繞損傷細胞器或細胞溶質(zhì)形成的液泡狀結(jié)構(gòu)-自噬體。(如箭頭所示)

2.4甲酸鈉可使細胞內(nèi)活性氧ROS水平增加

用DCFH - DA染色檢測細胞內(nèi)活性氧的生成。DCFH-DA容易經(jīng)細胞膜擴散,并被酯酶脫去乙酰基，變成非熒光作用的DCFH 。在活性氧的作用下，DCFH迅速被氧化成高熒光產(chǎn)品，DCF。因此，DCF的熒光強度與細胞內(nèi)活性氧的數(shù)量成正相關(guān)。如圖4A所示，用15和30 mM濃度甲酸鈉處理的661W細胞，熒光強度增加。圖4B所示，細胞經(jīng)15和30 mM甲酸鈉處理24 h，細胞內(nèi)活性氧水平有所增加。Plt;0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。這些結(jié)果表明，細胞內(nèi)活性氧水平的增加可能參與甲酸鈉-誘導(dǎo)661W細胞毒性損傷過程。

圖3 western blotting法檢測LC3、Beclin 1、p-mTor的蛋白表達水平

圖4流式細胞儀分析檢測甲酸鈉處理的661W細胞內(nèi)活性氧的生成用DCFH-DA染色檢測分析甲酸鈉(15和30mM)處理的661W細胞，并與對照組相比較。(A)觀察熒光強度信號得知，甲酸鈉處理的661W細胞熒光強度增加。(B)用甲酸鈉(15和30mM)處理和對照組661W細胞的DCF熒光強度。(*Plt;0.05;**Plt;0.01)。

2.5甲酸鈉可使細胞內(nèi)的JNK通路被激活

本實驗中，用不同濃度(0，15和30 mM)的甲酸鈉處理661W細胞，western blotting法檢測JNK 和 pJNK蛋白表達。如圖5所示,甲酸鈉處理661W細胞后，其pJNK蛋白表達水平增加,JNK蛋白質(zhì)表達水平?jīng)]有顯著變化。這些結(jié)果表明,當用甲酸鈉處理661W細胞可是細胞JNK信號通路被激活。

圖5westernblotting法檢測JNK和pJNK蛋白表達661W細胞暴露在濃度為0(對照組),15或30mM甲酸鈉中培養(yǎng)。

3 討論

甲醇對視神經(jīng)及視網(wǎng)膜有選擇性毒性作用，致使視網(wǎng)膜壞死和視神經(jīng)脫髓鞘病變。急性甲醇中毒主要眼部的損害由輕到重常表現(xiàn)為：視物模糊、眼痛、眼前黑影、閃光感、復(fù)視,以及視力下降、視野損害甚至視力喪失、對光反射消失等[8,9]。

活性氧類(reactive oxygen species,ROS)是一系列含氧的活性物質(zhì),對調(diào)節(jié)細胞程序和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用[10]。如果活性氧在胞內(nèi)蓄積，可能引發(fā)氧化應(yīng)激，致使細胞成分損傷，有研究證實，活性氧可以作為一種信號分子，參與細胞自噬性死亡的過程[11,12]。

眾所周知,線粒體呼吸鏈電子傳遞的失調(diào),或抗氧化酶的功能障礙,都可能導(dǎo)致活性氧的積累[13]。此外,活性氧與JNK信號通路的高生物活性和功能的第二信使相關(guān)。JNK作為有絲分裂原激活蛋白激酶家族中的一員,參與多種細胞通路的信號傳遞,包括細胞凋亡、細胞自噬、炎癥和致癌作用[14]。在本研究中,當甲酸鈉作用661W后，JNK信號通路被激活，活性氧水平增加。ROS是JNK通路強有力的催化劑，可以氧化失活內(nèi)源性JNK抑制劑,這些抑制劑包括JNK磷酸酯酶、谷胱甘肽S -轉(zhuǎn)移酶[15]。JNK通路的激活可誘導(dǎo)ROS積累,ROS以正反饋的方式激活JNK。本研究表明，甲酸鈉使細胞內(nèi)ROS增多，JNK 和 pJNK蛋白表達水平增加，pJNK蛋白增加更為明顯，JNK信號通路激活，而這種激活可能促進甲酸鈉作用的661W細胞發(fā)生自噬。

自噬是一種負責(zé)蛋白質(zhì)和細胞器清除的細胞通路,因此一定程度的自噬可以維持正常的細胞穩(wěn)態(tài)，但過度的自噬活動會促進細胞死亡[16]。本研究中,甲酸鈉作用的661W細胞中觀察到自噬體形成，LC3II、Beclin-1蛋白表達水平的增加，p-mTOR水平下降。透射電鏡可觀察到典型的自噬超微結(jié)構(gòu)，被認為是證明細胞自噬的金標準[17]。本研究中，透射電鏡下，觀察到甲酸鈉暴露的661W細胞自噬體形成，如圖2所示，可見膜狀結(jié)構(gòu)包繞損傷細胞器或細胞溶質(zhì)形成的液泡狀結(jié)構(gòu)-自噬體。Beclin-1 和LC-3 作為自噬相關(guān)蛋白，可在一定程度上反映自噬表達與其強烈的程度，是評估自噬活性的可靠指標[17]。Beclin-1 是重要的自噬調(diào)控因子，其主要通過控制自噬體的形成，從而調(diào)節(jié)自噬活性[18]。在本研究中，甲酸鈉處理的661W細胞，自噬水平增加，Beclin-1 蛋白表達水平增加。LC3 主要以LC3-Ⅰ和LC3- Ⅱ兩種形式存在，在western blotting試驗中，LC3- Ⅱ較LC3- Ⅰ變化更加明顯，LC3- Ⅱ的含量能很好地反映細胞的自噬活性，因此被認為是自噬的特征標記[19]。本研究結(jié)果顯示甲酸鈉暴露的661W細胞，LC3- Ⅱ的表達水平增加，而LC3- Ⅰ表達水平變化不明顯。p-mTOR是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，作為自噬的主要負調(diào)控者在蛋白合成以及自噬抑制中占據(jù)著核心的位置[20,21]，當細胞接受到外界干擾或者營養(yǎng)匱乏時，p-mTOR 活性受到抑制而自噬被激活。在本研究結(jié)果顯示甲酸鈉暴露的661W細胞，p-mTOR的表達水平減少。

總之,本研究表明,甲酸鈉誘導(dǎo)661W細胞自噬一定程度上是通過觸發(fā)JNK通路實現(xiàn)的。在甲酸鈉作用661W細胞造成細胞損傷的過程中，自噬水平有所增加。自噬可能參與大量的視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機制.包括年齡-相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變等，甲酸鈉誘導(dǎo)661W細胞的功能障礙的研究，可能會為這些疾病發(fā)病機制的研究提供有價值的依據(jù)。

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Sodiumformateinducesretinalphotoreceptorcellsautophagy

JINYan-ling,WANGYing,CHENYue,etal.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveIn recent years,alcoholic poisoning has occurred due to drinking fake wine.The aim of this study was to investigate the variation of cell autophagy level,in the process of sodium formate inducing retinal photoreceptor cells (661 w) damaged.Methods661W cells were exposed to 15 and 30 mM concentration of sodium formate for 24h respectively,then,the autophagy level was detected by monodansylcadaverine staining.The autophagy formation of 661W cells was observed by transmission electron microscopy.The expression of microtubule associated protein LC3,p-mTOR,Beclin 1,JNK and p-JNK were evaluated by western blotting.Intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected using 2',7'.dichlorofluorescein diacetate (DCFH.DA) staining,followed by flow cytometric analysis.ResultsCompared with the control group,sodium formate at concentrations of 15 or 30 mM markedly increased the level of autophagy level was observed under fluorescence microscope.Autophagosomes were observed under transmission electron microscope.Western blotting showed that the levels of LC3-II.Beclin 1,p JNK exhibited increased.while the expression of p-mTOR protein was decreased.And flow cytometry showed that the level of reactive oxygen species increased.ConclusionSodium formate can induce autophagy of 661W cells.Autophagy may be involved in the process of visual impairment caused by fakes poisoning.

methanol poisoning;sodium formate;autophagy;661W cells;ROS

吉林省發(fā)展和改革委員會資助項目(2015Y032-1) 吉林省科技廳資助項目(20170623093-11TC)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1995-05

R392

A

金艷玲(1992-)，女，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事青光眼及視神經(jīng)疾病方面的研究。

2017-03-17)