孫大菊，張玉成，王雅麗

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長春130033;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學研究中心，130033; 3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長春130033)

Decorin對骨肉瘤MG63細胞侵襲和轉移的影響

孫大菊1，張玉成2*，王雅麗3*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長春130033;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學研究中心，130033; 3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長春130033)

骨肉瘤是最普遍的發(fā)生于長骨干骺端的一種惡性腫瘤。盡管最近幾十年骨肉瘤的治療取得了長足的進步，但是由于化療藥物抵抗、放療以及輔助治療的有限性，加之惡性骨肉瘤具有較高的侵襲和轉移性，使得晚期骨肉瘤的治療和預后的效果仍然不理想。因此，闡明骨肉瘤轉移和侵襲的機制，以及尋找有效的治療方法對于骨肉瘤的治療和發(fā)病機理的研究將起到重要的作用[1-3]。核心蛋白聚糖(decorin，DCN)是一種屬于分泌型和富含亮氨酸多糖基因家族成員之一，其主要存在于結締組織中，研究表明decorin能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖[4]。本研究將利用脂質體轉染decorin基因進入到骨肉瘤MG63細胞中，探討decorin對于骨肉瘤MG63細胞的生長、轉移與侵襲的抑制作用，為進一步研究decorin抑制腫瘤的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料抗人decorin單克隆抗體(Ramp;D公司)；MTT、PI和細胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術研究所)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；western blot相關試劑來自本實驗室。Transwell chamber(Corning公司)，Matrigel 基底膜(BD bioscience)；Diff-Quick試劑盒染色(Fisher scientific)。

1.2細胞培養(yǎng)和轉染MG63細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM，置于5 % CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。重組decorin真核表達載體(pcDNA3.1-DCN)的構建方法如前期文章所述[5]。應用脂質體2000將已構建完成含有decorin基因的真核表達載體pcDNA3.1-DCN或pcDNA3.1分別轉染到MG63細胞中。本研究共分為兩組：空白質粒對照組(對照組)和轉染DCN實驗組(實驗組)。DCN蛋白的表達應用western blot進行檢測。

1.3MTT檢測細胞增殖情況用胰酶消化MG63細胞，吹打以制成單細胞懸液，并均勻種植于96孔板中，待細胞生長到90 %左右細胞融合時，利用脂質體進行轉染，轉染24 h后記為第1天，用MTT法連續(xù)3天檢測細胞增殖狀況。測定當天，每孔加入20 μl的5 mg/ml濃度的MTT，避光孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μl的DMSO溶解藍紫色結晶，經振蕩充分溶解后，利用酶標儀490 nm波長處測定光密度值，每組重復3次，統(tǒng)計分析后繪制細胞生長曲線以觀察細胞增殖情況。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡將細胞種植于培養(yǎng)皿中，待細胞長到90 %融化時，利用脂質體進行轉染，轉染第3天后，胰蛋白酶進行消化，均勻吹打，PBS清洗細胞兩次，分別按照細胞周期和細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。細胞周期步驟大體如下：50 μl的細胞懸液加入1 000 μl 70%冰乙醇過夜，固定完全后，用PBS清洗2次，最終留有50 μl左右的細胞原液，分別加入25 μl碘化丙啶、10 μl RNase和500 μl的染色緩沖液，避光30 min，最后流式細胞儀檢測細胞周期。細胞凋亡步驟大體如下：細胞懸液1 000 g離心5 min，加入195 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC，以及加入10 μl碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min，最后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5劃痕實驗和Transwell小室法劃痕實驗：將細胞接種于敷有纖維粘連蛋白的平皿中，待細胞長到100 %融合時，在單層細胞表面用無菌槍頭進行劃痕，換掉培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，計算傷口愈合的百分率。每組細胞重復三次實驗后進行統(tǒng)計學分析。Transwell小室法：細胞(5×104個)重懸在100 μl含有1 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；對于遷移實驗，將細胞加入到transwell chamber上層小室中，下層小室放入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基；對于侵襲實驗，transwell chamber上層小室包被10 μg/ml的growth-factor-reduced Matrigel 基底膜；孵育24 h后，去除過濾膜上層的非侵襲細胞，固定過濾膜下層表面遷移的細胞并用Diff-Quick試劑盒染色和拍照。每孔中隨機計算5個視野下細胞數(shù)，用每視野平均細胞數(shù)來代表侵襲程度。

1.6統(tǒng)計分析統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0進行t檢驗，數(shù)值用均值和標準差表示，Plt;0.05代表有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1DCN蛋白表達情況Western blot方法檢測對照組和實驗組DCN表達情況，如圖1所示，可見轉染重組decorin基因后，轉染組DCN蛋白表達明顯高于對照組，表明本實驗已經成功地將DCN基因轉染到骨肉瘤MG63細胞中。

圖1 轉染DCN的表達情況

2.2DCN抑制骨肉瘤MG63細胞生長MTT檢測發(fā)現(xiàn)，瞬時轉染重組decorin基因第三天，與對照組相比，轉染組細胞明顯生長緩慢，具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05，見圖2)，而轉染的前兩天，兩者比較沒有統(tǒng)計學意義，可見DCN能夠抑制MG63細胞的增殖。

2.3DCN阻止骨肉瘤MG63細胞于G0/G1期細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)(見圖3)，與對照組相比，轉染組細胞G0/G1期細胞明顯增多，而S期和G2/M期明顯減少(Plt;0.05)，可見DCN可以將MG63細胞阻止于G0/G1期。

2.4DCN對于骨肉瘤MG63細胞凋亡的影響細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組細胞相比，轉染組細胞凋亡數(shù)明顯增多，兩者相比具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05，見圖4)，表明DCN可以促進MG63細胞凋亡。

2.5DCN抑制骨肉瘤MG63細胞侵襲與轉移劃痕實驗表明轉染組細胞傷口愈合百分率明顯低于對照組(Plt;0.05，見圖5)，Transwell小室法顯示轉染組細胞侵襲與轉移的細胞數(shù)明顯低于對照組(Plt;0.05)，這些結果共同表明DCN能夠抑制MG63細胞的侵襲與轉移。

圖2 DCN抑制MG63細胞的生長曲線

圖3 代表性的細胞周期結果圖和統(tǒng)計結果圖

圖4 代表性的細胞凋亡結果圖及統(tǒng)計結果

圖5 傷口愈合實驗、細胞遷移和侵襲實驗

3 討論

在本研究中，我們將decorin基因轉染到骨肉瘤MG63細胞中，研究發(fā)現(xiàn)decorin基因能夠抑制骨肉瘤MG63細胞生長、將細胞阻止在G0/G1期、促進細胞凋亡、抑制骨肉瘤MG63細胞的侵襲和遷移。

以前的研究表明decorin可以抑制多種腫瘤細胞的生長和增殖，例如肝癌[6,7]、結腸癌[8]、乳腺癌[9]、鱗癌[10]等。另外，Decorin在許多上皮來源腫瘤中表達下調，這表明decorin可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到抑癌基因作用[11]。此外，decorin不但能夠在體外抑制腫瘤細胞生長，而且在體內也能夠起到相同的作用[12]。同時，許多研究顯示decorin能夠抑制腫瘤的轉移和侵襲；比如Silvia 等研究發(fā)現(xiàn)移植有乳腺癌細胞的小鼠，經過DCN治療之后，原發(fā)性腫瘤體積明顯縮??；DCN能夠專門靶向抑制腫瘤細胞，而對正常的細胞沒有影響，而且研究還發(fā)現(xiàn)DCN能夠顯著阻止乳腺癌細胞的肺部轉移；另一項研究也發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達DCN的骨肉瘤細胞系LM8，將其注射種植于小鼠背部，觀察骨肉瘤的肺轉移，發(fā)現(xiàn)DCN能夠顯著延長小鼠生存的時間，而且沒有發(fā)現(xiàn)肺部轉移，可見DCN可以阻止骨肉瘤的肺部轉移。這些研究均表明decorin可以抑制體內和體外多種上皮來源的腫瘤，且能夠抑制腫瘤的轉移[13,14]。

在本研究中，我們的成果也顯示，decorin可以抑制骨肉瘤MG63細胞的增殖、侵襲和轉移，這將有利于闡明骨肉瘤的侵襲與轉移的機制，同時為decorin抑制腫瘤的作用及其作用機制的研究奠定基礎。

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吉林省衛(wèi)生計生青年科研項[2014Q25]，白求恩醫(yī)學科研支持計劃項目[2013207058]

*通訊作者;*相同貢獻

1007-4287(2017)11-1987-04

孫大菊(1980-)，女，碩士，主管技師，主要從事細胞病理學診斷及技術。

2017-01-18)