張 鑫，張 迪，饒艷偉，宋曉斌*

(1.吉林省人民醫(yī)院 急診外科,吉林 長春130021;2.長春理工大學(xué)醫(yī)院)

烏司他丁聯(lián)合順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡作用的研究

張 鑫1，張 迪2，饒艷偉1，宋曉斌1*

(1.吉林省人民醫(yī)院 急診外科,吉林 長春130021;2.長春理工大學(xué)醫(yī)院)

胃癌是胃粘膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率都位于第三位的惡性腫瘤。而且胃癌的發(fā)病年齡無局限性，胃癌的發(fā)病年齡常見于40-60歲[1]?，F(xiàn)階段胃癌的治療方法主要是手術(shù)切除，之后化療輔助治療。順鉑為傳統(tǒng)化療藥物，其與DNA交聯(lián)誘導(dǎo)雙鏈斷裂而引起損傷，發(fā)揮其毒性作用，應(yīng)用在胃癌化療的不同時(shí)段，如輔助化療的ECF方案，姑息化療的DCF方案和分子靶向治療的PF+曲妥珠單抗方案，在指南中都被作為Ⅰ類證據(jù)推薦臨床應(yīng)用[2]?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)順鉑化療有可能產(chǎn)生耐藥，降低了其治療功效。為了減少順鉑對(duì)化療癌癥的耐藥性，聯(lián)合其他藥物治療成為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。烏司他丁(UTI)為廣譜的蛋白酶抑制劑，可抑制多種水解酶活性(蛋白、脂類、糖類)，具有抗炎、減少細(xì)胞和組織損傷、改善微循環(huán)和組織灌注等作用。UTI被應(yīng)用于治療急性胰腺炎、膿毒癥、ALI等，近年來在其抗腫瘤效應(yīng)中也被很多研究者關(guān)注[3]。羅杰的研究證明了抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響細(xì)胞的侵襲能力的下降[4]。所以，本研究設(shè)想聯(lián)合應(yīng)用烏司他丁是否增加胃癌細(xì)胞系的凋亡作用，進(jìn)而增加順鉑的化療效果。所以本研究以胃癌細(xì)胞BGC-823為研究對(duì)象，加入烏司他丁和順鉑處理細(xì)胞后，觀察細(xì)胞的生存率以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，探討聯(lián)合應(yīng)用烏司他丁是否增加胃癌細(xì)胞系的凋亡作用。

1 材料與方法

1.1藥品及主要試劑順鉑(美國 Sigma 公司)，烏司他丁(天普生化醫(yī)藥股份有限公司公司)，Cleaved-caspase3蛋白抗體(美國 Abcam公司)，Cleaved-PARP蛋白抗體(美國 Abcam公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞BGC-823由吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。BGC-823采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，5% CO2的恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并保持一定的濕度。所有細(xì)胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，正常組給予更換培養(yǎng)液；順鉑組給予更換含0.8 μg/ml順鉑培養(yǎng)液；烏司他丁組給予更換含400 U/ml的烏司他丁培養(yǎng)液；順鉑+烏司他丁組為加入0.8 μg/ml順鉑+400 U/ml烏司他丁作用。

1.3MTT法檢測(cè)胃癌細(xì)胞存活率按使用說明書用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)法檢測(cè)細(xì)胞生存能力。全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長590 nm)測(cè)定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.4WesternBlot檢測(cè)胃癌細(xì)胞BGC-823中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，Bio-Rad 法測(cè)定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟操作，測(cè)定樣品的蛋白濃度。用ImageJ圖像處理軟件計(jì)算各條豆類灰度值，分析Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)情況。目的蛋白與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的灰度值的比值進(jìn)行描述表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)順鉑和烏司他丁處理過的胃癌細(xì)胞生存率

MTT結(jié)果顯示：與正常組相比，順鉑組、烏司他丁組、順鉑+烏司他丁組的細(xì)胞生存率明顯降低，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。與順鉑組和烏司他丁組相比，順鉑+烏司他丁組的細(xì)胞生存率明顯降低，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。見圖1。

2.2WesternBlot檢測(cè)胃癌細(xì)胞中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達(dá)

與正常組相比，順鉑組、烏司他丁組、順鉑+烏司他丁組的組中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP表達(dá)明顯增加；與順鉑組和烏司他丁組相比，順鉑+烏司他丁組的凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP明顯降低，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01),如圖2。

圖1 經(jīng)過順鉑和烏司他丁處理的胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞生存率

圖2 Western Blot檢測(cè)順鉑和烏司他丁處理的胃癌細(xì)胞Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達(dá)

3 討論

我國的所有癌癥中，胃癌的發(fā)病率居首位，死亡率高。其治療方案主要以手術(shù)為主，之后予以化療輔助治療。在根治性手術(shù)的圍手術(shù)期，常通過化療延長生存周期。對(duì)于病理惡性程度高的胃癌根治術(shù)后的患者，瘤體面積大于5 cm的多發(fā)性癌灶和根治術(shù)后復(fù)發(fā)的患者通常給予化療治療?，F(xiàn)在的化療藥物主要為順鉑、氟尿嘧啶、絲裂霉素、紫杉醇、阿霉、草酸鉑、拓?fù)涿敢种苿?、希羅達(dá)等化療藥物?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)順鉑化療有可能產(chǎn)生耐藥，降低了其治療功效[5]。為了減少順鉑對(duì)化療癌癥的耐藥性，聯(lián)合其他藥物治療成為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。本研究為了提高順鉑的化療藥物，擬聯(lián)合烏司他丁對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行處理。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用烏司他丁能降低胃癌細(xì)胞的生存率。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過烏司他丁處理過的胃癌細(xì)胞中凋亡標(biāo)志性相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase3和Cleaved-PARP的表達(dá)水平明顯增加，這說明烏司他丁能增加胃癌的凋亡水平。而烏司他丁被認(rèn)為是廣譜的蛋白酶體抑制劑，對(duì)胃癌細(xì)胞的作用可能通過對(duì)蛋白酶體的抑制作用，影響胃癌細(xì)胞中蛋白酶體的降解系統(tǒng)。王云花發(fā)現(xiàn)了烏司他丁能明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞lovo細(xì)胞的增殖和侵襲能力，以及增加了細(xì)胞中Caspase3的表達(dá)，增加了細(xì)胞的凋亡發(fā)生[6]。李燕在人絨毛膜癌細(xì)胞系中證實(shí)了烏司他丁通過抑制uPA的表達(dá)降低細(xì)胞的侵襲能力[7]。在程偉華的研究中發(fā)現(xiàn)了在胃癌組織中uPA表達(dá)增加[8]。所以，我們懷疑是不是烏司他丁通過影響細(xì)胞內(nèi)的uPA的表達(dá)來改變細(xì)胞的凋亡水平，還需要我們的后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。之后我們將烏司他丁與順鉑聯(lián)合處理胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)應(yīng)用順鉑組相比，聯(lián)合用藥組細(xì)胞生存率明顯降低，同時(shí)通過Western Blot我們還發(fā)現(xiàn)了胃癌細(xì)胞中Cleaved-Caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)水平明顯增加。這說明了聯(lián)合應(yīng)用烏司他丁與順鉑能明顯增加胃癌細(xì)胞的凋亡水平，其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。在現(xiàn)階段的研究中認(rèn)為胃癌組織中存在uPA表達(dá)增加，而uPA被認(rèn)為和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)系，同時(shí)我們還知道烏司他丁是一個(gè)廣譜的蛋白酶體抑制劑，在本研究中我們還不能確定烏司他丁是通過uPA的改變來影響細(xì)胞凋亡水平，還是通過其蛋白酶體抑制作用來增加順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡的作用，這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，本研究證明了聯(lián)合應(yīng)用順鉑和烏司他丁能增加人胃癌細(xì)胞的死亡率，增加細(xì)胞的凋亡的發(fā)生。順鉑和烏司他丁聯(lián)合用藥可能提高對(duì)抗腫瘤的敏感性，有可能為臨床的胃癌患者的化療提供一種新的治理策略，但是其具體作用途徑還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

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[4]羅 杰.烏司他丁和泰索帝對(duì)人乳腺癌增值、侵襲及uPA、uPAR、ERK表達(dá)的影響[D].重慶醫(yī)科大學(xué)碩士論文，2010.

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[6]王云花.烏司他丁對(duì)人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞增值，侵襲，凋亡及HMGB1的影響[D].南方醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士畢業(yè)論文.

[7]李 燕.烏司他丁對(duì)人絨毛膜癌uPA表達(dá)及侵襲的影響[D].中南大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2010.

[8]程偉華.p-p38和uPA在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[D].南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士畢業(yè)論文，2010.

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1973-02

張?chǎng)?，男，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事胃癌的外科治療方面研究。

2016-07-13)