向航 馬洪 段曉峰

IGFBP-3在唾液腺多形性腺瘤中的表達(dá)及意義

向航 馬洪 段曉峰

目的研究胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)在唾液腺多形性腺瘤(SPA)中的表達(dá)。方法采用Western blot檢測(cè)IGFBP-3在40 例SPA、40 例正常腺體組織及10 例惡性唾液腺腫瘤組織中的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)IGFBP-3 mRNA在50 例SPA組織、50正常腺體組織及10 例唾液腺惡性腫瘤中的表達(dá)。結(jié)果IGFBP-3蛋白在唾液腺正常組織(N組:8.54±3.95)的表達(dá)(A值)顯著高于多形性腺瘤組(PA組:4.78±2.07)及惡性腫瘤組(CA組: 3.63±2.27)(Plt;0.05)。而PA組與CA組之間則不存在顯著差異(Pgt;0.05)。IGFBP-3 mRNA在SPA組織與惡性腫瘤組織中的表達(dá)均低于正常組織(PA/N組：0.654±0.387，CA/N組:0.452±0.229),PA組與CA組不存在顯著差異(Pgt;0.05)；不同包膜浸潤(rùn)程度的多形性腺瘤組織中相對(duì)含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，在年齡、性別及有無(wú)復(fù)發(fā)上無(wú)明顯差異。結(jié)論IGFBP-3在多形性腺瘤中的低表達(dá)可能減低了拮抗IGF-1R的作用，引起腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤形成。

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3； 涎腺多形性腺瘤(SPA)； 蛋白免疫印跡； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

多形性腺瘤(pleomorphic adenoma, PA)是唾液腺腫瘤中最常見(jiàn)的一種,占唾液腺上皮性腫瘤的50%以上，占全部良性腫瘤的87%以上[1]。學(xué)者在腮腺腫瘤的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，多形性腺瘤在其中構(gòu)成比最大[2]。該腫瘤雖為良性，但其包膜不完整且常有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，極易惡變和術(shù)后易復(fù)發(fā)[3]。研究表明，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展被認(rèn)為是多基因共同作用的結(jié)果，這些基因在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等多個(gè)方面發(fā)生作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP-3)是IGF信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子[4]。IGFBP-3在結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá)[5-9]。本研究應(yīng)用Western blot及Real-time PCR檢測(cè)IGFBP-3蛋白及mRNA在多形性腺瘤中的表達(dá)情況，并比較其在不同臨床特征組中表達(dá)的差異及意義。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

標(biāo)本取自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院頜面外科及貴州省腫瘤醫(yī)院2013-03～2015-10手術(shù)切取新鮮組織,PA組50例標(biāo)本其病理類(lèi)型經(jīng)病理證實(shí)為多形性腺瘤；50 例正常組(N組)組織取自多形性腺瘤邊界1 cm以外正常腺體組織；CA組10 例組織取自術(shù)后病理證實(shí)為唾液腺惡性腫瘤。所有新鮮組織離體后，一部分立即RNA Later封存，一部分PBS清洗后，-80 ℃冰箱保存待用。標(biāo)本的獲取經(jīng)倫理學(xué)會(huì)審核同意。

1.2 試劑及儀器

鼠抗人IGFBP-3單克隆抗體、小鼠抗人β-tubulin單克隆抗體、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗(Abmart公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Beyotime)，Millipore Immobilon Western 化學(xué)發(fā)光HRP底物,Synergy H4全功能酶標(biāo)儀，組織細(xì)胞破碎儀(bullet blender)，Bio-rad Mini-PROTEAN電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，數(shù)字成像分析系統(tǒng)。RNAlater組織固定液、Dynabeads mRNA DIRECTTMKit(Ambion公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和PCR反應(yīng)熒光 Light Cycler480 SYBR Green ⅠMaster(Roche公司)；CFX connect Real Time System PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD)。

設(shè)計(jì)及合成目的基因及內(nèi)參基因引物。IGFBP-3上游：5'-3' TTCCAGTAGTCAGCAAAGAGCA；下游：3'-5' CCGCCTAAGTCACAAAGTCAGT。內(nèi)參基因GAPDH上游：5'-3' CAGGAGGCATTGCTGATGAT，下游：3'-5' GAAGGCTGGGGCTCATTT。購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白免疫印跡(Western blot) 切取50 mg組織,加入細(xì)胞裂解液(含PMSF)，利用組織破碎儀裂解組織，提取總蛋白(-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，統(tǒng)一上樣量每孔40 μg,聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%),恒壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛奶封閉2 h，轉(zhuǎn)入一抗稀釋液(IGFBP-3為1∶5 000，β-tubulin為1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記過(guò)的二抗稀釋液(1∶8 000)，室溫?fù)u床2 h后TBST洗滌。Immobilon Western 化學(xué)發(fā)光HRP底物檢測(cè)抗體結(jié)合，暗室內(nèi)顯影，顯色條帶掃描后通過(guò)數(shù)字成像系統(tǒng)Image J進(jìn)行光密度掃描分析。計(jì)算蛋白相對(duì)A值=A(IGFBP-3)/A(β-tubulin)。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定mRNA(Real-time PCR)

利用Dynabeads mRNA DIRECTTMKit試劑盒提取組織mRNA：取存儲(chǔ)在RNAlater試劑(-80 ℃)中的組織2～10 mg于LB裂解液(含蛋白溶解酶K)中，55 ℃恒溫促進(jìn)組織消化。加入Dynabeads Oligo[dT]25使磁珠與mRNA結(jié)合，搖床10 min后立即放入磁場(chǎng)中。移除上清液，依次用Washing Buffer A/B液洗滌，去除上清。加入Tris-HCl(pH 7.5)溶解磁珠，80 ℃恒溫2 min得到mRNA。將提取出的 mRNA與Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Roche公司)的cDNA Synthesis Master Mix混合，放入熱循環(huán)儀中逆轉(zhuǎn)錄，42 ℃維持30 min，85 ℃失活5 min，4 ℃保持5 min。將循環(huán)結(jié)束后獲得的cDNA用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)得濃度及純度，將其稀釋后與Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master混合進(jìn)行擴(kuò)增：SYBR Green 5.0 μl，上下游引物4.0 μl，模板1.0 μl。用CFX connect Real Time System PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min，變性95 ℃，15 s，退火65 ℃，10 s，共60 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3 個(gè)復(fù)孔，取Ct平均值。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量ΔCt=Ct(tag)-Ct(ref)，ΔΔCt=ΔCt(腫瘤組)-ΔCt(正常組)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床資料數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Plt;0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測(cè)IGFBP-3蛋白的表達(dá)

圖1～2的檢驗(yàn)結(jié)果可以知道，IGFBP-3在正常腺體組織(N組)中蛋白相對(duì)A值為8.54±3.95，在多形性腺瘤組織(PA組)中為4.78±2.07，在唾液腺惡性腫瘤組織(CA組)中為3.63±2.27。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后得出，N組IGFBP-3表達(dá)量顯著高于PA組(t=6.36，P=0.000)及CA組(t=3.756，P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而PA組與CA組之間則不存在顯著差異(t=1.531，P=0.132)。

圖 1 IGFBP-3蛋白在唾液腺正常腺體組織、多形性腺瘤及惡性腫瘤中的表達(dá)

Fig 1 The expression of IGFBP-3 protein in normal tissue, pleomorphic adenoma and carcinoma of salivary gland

2.2 Real-time PCR 檢測(cè)mRNA的表達(dá)結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，IGFBP-3在唾液腺多形性腺瘤組織與惡性腫瘤組織中的表達(dá)均低于正常組織(多形性腺瘤組/正常組：0.654±0.387，惡性腫瘤組/正常組:0.452±0.229)，而多形性腺瘤中的表達(dá)較惡性腫瘤組無(wú)明顯差異(Z=-1.349，P=0.177gt;0.05)。在臨床相關(guān)性分析中，IGFBP-3在有無(wú)包膜浸潤(rùn)的多形性腺瘤組織中相對(duì)含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與患者的年齡、性別及是否復(fù)發(fā)無(wú)明顯差異(表 1)。

圖 2 唾液腺正常腺體組織、多形性腺瘤及惡性腫瘤中IGFBP-3的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Fig 2 Comparision of the expression of IGFBP-3 protein in normal tissue, pleomorphic adenoma and carcinoma of salivary gland

表1 IGFBP-3 mRNA表達(dá)與多形性腺瘤的臨床相關(guān)性

Tab 1 Association between IGFBP-3 mRNA expression and clinical characteristics in patients with pleomorphic adenoma

組別nx±sZ值P值性別 男160.716±0.387-0.7690.442女340.625±0.389年齡 lt;60歲380.679±0.396-0.8630.388≥60歲120.577±0.362浸潤(rùn)包膜是220.501±0.324-2.4040.016否280.775±0.394復(fù)發(fā) 有80.664±0.320-0.1320.895無(wú)420.653±0.401

3 討 論

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin_like growth factors，IGFs)信號(hào)系統(tǒng)由IGF配體、IGF受體及IGF結(jié)合蛋白(IGFBPs)組成。IGF系統(tǒng)促增殖生長(zhǎng)的活性主要由IGF-1R介導(dǎo)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡。IGFBP-3可以通過(guò)限制的IGF-促有絲分裂和細(xì)胞存活的動(dòng)作限制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展[10]。IGFBP-3比IGF-IR有更大的親和力，可以競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合IGF配體，拮抗IGF系統(tǒng)中主要作用促細(xì)胞增殖及抑制凋亡的IGF-1R，并可以調(diào)節(jié)在許多細(xì)胞類(lèi)型的IGF動(dòng)作。IGFBP-3可以通過(guò)限制IGF-1R促有絲分裂和細(xì)胞存活的動(dòng)作限制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展[11]。

本文結(jié)果表明IGFBP-3蛋白和mRNA在多形性腺瘤及惡性涎腺腫瘤中表達(dá)均較正常腺體組織低，在多形性腺瘤及惡性腫瘤組織中表達(dá)無(wú)明顯差異。結(jié)果與其在肺癌[12]、食管鱗癌[13]、惡性黑色素瘤[14]中表達(dá)下調(diào)具有一致性。推測(cè)多形性腺瘤作為臨界瘤，其發(fā)生發(fā)展在分子水平的表現(xiàn)上可能與惡性腫瘤具有一定的相似性。在臨床相關(guān)分析中，IGFBP-3在有無(wú)包膜浸潤(rùn)的多形性腺瘤中有明顯差異，有包膜浸潤(rùn)時(shí)其表達(dá)較無(wú)包膜浸潤(rùn)更低。IGFBP-3的低表達(dá)，可能使唾液腺腫瘤在發(fā)生發(fā)展中對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制降低，促細(xì)胞有絲分裂，細(xì)胞增殖，最終引起腫瘤發(fā)生發(fā)展。但其在涎腺腫瘤中通過(guò)何種路徑被激活至發(fā)揮生物學(xué)作用，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

參考論文

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(收稿： 2016-07-09 修回： 2016-12-23)

TheexpressionandsignificanceofIGFBP-3insalivaryglandpleomorphicadenoma

XIANGHang，MAHong，DUANXiaofeng.

550004Guiyang,OralandMaxillofacialSurgery,TheHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,China

Objective: To investigate the expression of insulin-like growth factor binding protein 3(IGFBP-3) in salivary pleomorphic adenoma(SPA).MethodsThe expression of IGFBP-3 protein in 40 cases of SPA(group SPA), 40 of normal glandular tissue(group N) and 10 of salivary gland malignant tumor(group CA) was detected by Western blot. The expression of IGFBP-3 mRNA in 50 cases of SPA, 50 of salivary gland normal tissue and 10 of CA was detected by qRT-PCR.ResultsThe expression(A value) of IGFBP-3 protein in group N, SPA and CA was 8.54±3.95, 4.78±2.07, 3.63±2.27 respectively. The expression ration of IGFBP-3 mRNA of group NvsSPA or CA,Plt;0.05; SPAvsCA,Pgt;0.05(SPA/N was 0.654±0.387, CA/N: 0.452±0.229) respectively，but showed no significance difference between SPA and the CA groups(Pgt;0.05). Difference of IGFBP-3 mRNA expression was observed with different envelope infiltration of SPA(Plt;0.05), no significant difference was observed in different age，gender or relapse groups.ConclusionIGFBP-3 Low expression of IGFBP-3 in pleomorphic adenomas may reduce the antagonism of IGF-1R, causing the proliferation of tumor cells and promote tumor formation.

Insulin-likegrowthfactorbindingprotein3(IGFBP-3);Salivarypleomorphicadenoma(SPA);Westernblot;Real-timePCR

貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(編號(hào)： 黔科合[2013]3012號(hào))

550004 貴陽(yáng), 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科

馬洪 E-mail：mahong1966@126.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.025