高娜 陶錚 段俊國

·實驗研究·

糖尿病視網膜病變高糖細胞模型的建立

高娜1陶錚2段俊國2

目的建立一種高糖刺激下的糖尿病視網膜病變的細胞模型。方法分別采用不用葡萄糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVEC),觀察細胞在不同時間點的細胞活性和細胞利用葡萄糖的能力,HUVEC分別與不同濃度的葡萄糖(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)共同孵育不同時間(6h、12h、24h、48h、72h),570nm處測OD值。結果各葡萄糖組對HUVEC活力的抑制率隨著葡萄糖濃度的升高,作用時間的延長而升高。30 mmol/L和35 mmol/L的葡萄糖作用48h及48h以上對HUVEC活性(OD值)有明顯抑制作用(Plt;0.01);各實驗組葡萄糖濃度隨時間延長均有不同程度的降低,且各組減低程度不同,其中30mmol/L的實驗組中的葡萄糖濃度在48h和72h處降低最顯著。結論30mmol/L 是篩選糖尿病視網膜病變藥物細胞模型中最佳的細胞培養(yǎng)濃度,培養(yǎng)時間48h是觀測藥物干預效果的最佳時間點。

糖尿病視網膜病變； 高糖細胞模型； 人臍靜脈內皮細胞

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病微血管病變中最重要的表現,是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一,是醫(yī)學領域亟待解決的致盲性眼病難題。DR發(fā)病率高,有資料顯示,糖尿病患者DR的患病率高達27.29%。若不及早干預,DR將嚴重影響患者生存質量,加重社會負擔,并帶來高昂的醫(yī)療開支。

目前中醫(yī)藥治療糖尿病視網膜病的優(yōu)勢日益凸顯,其作用療效的相關研究尚缺乏統一標準。由于細胞模型的易操作性及易重復性,使得高糖刺激下的細胞模型廣泛用于中醫(yī)藥防治糖尿病視網膜病變的研究。但相關文獻中關于如何建立高糖培養(yǎng)下的細胞模型還鮮有報道。

本課題擬采用人臍靜脈內皮細胞為體外觀察對象。如何建立最能模擬人體實際體內環(huán)境下的細胞模型是本實驗的研究目的。國內外學者相繼建立了多種用于糖尿病研究的細胞模型,通過控制其外環(huán)境的理化因素實現穩(wěn)定條件下藥物和其它作用的監(jiān)測研究。

高糖培養(yǎng)細胞模型的建立既要符合細胞能夠維持生長代謝的基本條件,又要模擬體內高糖環(huán)境下對細胞有相應損害的生長環(huán)境。對此,本課題同時采用兩種方法進行考量,一是采用MTT比色法檢查細胞增殖能力,二是同時測定細胞代謝的實時葡萄糖濃度,即間接反映細胞在高糖培養(yǎng)模式下的代謝活性,綜合兩者即可篩選出最佳細胞培養(yǎng)的高糖濃度及觀測點。

1 材料與方法

1.1實驗細胞

人臍靜脈內皮細胞,代號:HUVEC,來源:中科院上海細胞庫。

1.2主要試劑

DMEM低糖:SH30021.01(Hyclone);南美胎牛血清:FB15011,CLARK生產;MTT:M-2128(Sigma);胰酶(+EDTA):J150031(Hyclone);二甲基亞砜(DMSO):D-5879(Sigma);葡萄糖:G8270,(sigma)。葡萄糖(Glu)測試盒,F006(南京建成生物工程研究所)。

MTT配制:稱取250mg MTT,避光條件下溶于50ml PBS中,在60°C水浴條件下小心晃動,使其溶解,用0.22um的微孔濾膜過濾分裝,-20°C條件下長期保存。用時,無血清培養(yǎng)基稀釋為終濃度0.5mg/ml。

1.3方法

1.3.1MTT檢測細胞活性

細胞復蘇后按照1:3傳代培養(yǎng)。

取對數生長期的細胞,用PBS清洗,胰蛋白酶消化離心(1000rpm,5min)后吸除上清液,加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液;用血球計數板對該單細胞懸液所含細胞進行計數,調節(jié)細胞密度3.7*10∧4/ml,100ul/孔接種于無菌96孔板中,為防止長時間培養(yǎng)導致蒸發(fā),96孔板外圍一圈均加適量PBS保濕;待細胞完全貼壁后吸除原培養(yǎng)基,每孔加入200(l不同濃度的葡萄糖溶液,每個藥物濃度設6個平行孔,37℃、5%CO2恒溫分別繼續(xù)培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、72h(表1)。

表1 葡萄糖作用分組

小心吸除原有培養(yǎng)液,每孔加入200ul終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液;并輕輕晃動培養(yǎng)板數次,37℃、5%CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)4h;吸棄液體,每孔加入150ulDMSO,取出96孔板,用酶標儀測定其在570nm處的吸光度值;

1.3.2細胞上清液中葡萄糖的濃度測定

根據3.1MTT的初步結果選擇24小時,48小時及72小時為觀測點。各實驗組細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖經葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過氧化氫,后者在過氧化物酶的作用下,將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯縮合成可被分光光度計測定的醌類化合物。具體操作按照葡萄糖試劑盒說明進行。

1.4統計學處理

全部數據均用 SPSS10.0 統計軟件進行處理。

2 結果

2.1不同高糖濃度對細胞活性的影響

HUVEC分別與不同濃度的葡萄糖(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)共同孵育不同時間(6h、12h、24h、48h、72h),570nm處測OD值,結果如表2所示:與正常對照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)相比,30 mmol/L和35 mmol/L的葡萄糖作用24h對HUVEC活性(OD值)有抑制作用(Plt;0.05),48h及72h有明顯抑制作用(Plt;0.01);l0mmol/L和15mmol/L的葡萄糖作用72h、20 mmol/L的葡萄糖作用48h以上,40mmol/L的葡萄糖作用24h以上對HUVEC活力(OD值)有明顯抑制作用(Plt;0.01),并呈現一定的時間和濃度依賴關系(表2)。各葡萄糖組對HUVEC活力的抑制率隨著葡萄糖濃度的升高,作用時間的延長而升高(表3)。

2.2不同高糖濃度對細胞活性的影響

根據MTT細胞活性的檢測結果,本研究選取24h,48h,72h三個時間點檢測培養(yǎng)細胞上清液中葡萄糖的濃度。結果顯示:各實驗組葡萄糖濃度隨時間延長均有不同程度的降低(表4),且各組減低程度不同(表5),其中30mmol/L的實驗組中的葡萄糖濃度在48h和72h處降低最顯著。

3 討論

糖尿病視網膜病變(DR)系由于高血糖損害血管內皮細胞及細胞周細胞為基礎病理改變的代謝性疾病。目前新藥研究還普遍局限于動物模型,但整體動物模型篩選藥物效率低成本高,因此尋找藥靶基因,建立體外篩選的細胞模型,結合現代化新技術實現高通量藥物篩選,將成為DR治療的新方向。

表2 高糖對HUVEC細胞平均光密度的影響

注:各濃度葡萄糖組與空白對照組相比,*Plt;0.05;**Plt;0.01

表3 不同時間和不同濃度葡萄糖作用HUVEC的抑制率

表4 各實驗組不同時間段培養(yǎng)基中葡萄糖濃度值(平均值)

MTT比色法可用來檢測細胞增殖能力,即細胞數量;同時,細胞培養(yǎng)液中的葡萄糖又是細胞代謝的唯一能量來源,通過檢查培養(yǎng)液上葡萄糖降低值可以反映細胞利用葡萄糖的能力,即可間接反映細胞代謝活性[1,2,3]。

表5 各實驗組不同時間段培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低值

本實驗結果顯示,培養(yǎng)上清液中糖濃度為30mmol/L時,HUVEC利用葡萄糖的能力顯著,同時,與正常對照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)相比,30 mmol/L的葡萄糖作用48h及以上對HUVEC活性(OD值)有顯著抑制作用(Plt;0.01);故30mmol/L是篩選DR藥物細胞模型中最佳的刺激濃度,同時,為排除作用時間增長代謝產物本身對細胞產生的毒性作用,在該濃度刺激下作用48h是觀察藥物干預作用的最佳觀測點。

由于人視網膜材料來源有限,進行人視網膜血管內皮細胞的原代培養(yǎng)比較困難,很難獲得純化的人視網膜血管內皮細胞,傳代過程中細胞性狀也容易發(fā)生改變,因此本研究選用較易生長的HUVEC來進行研究,通過在體外增加培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的方法來培養(yǎng) HUVEC,模擬DR中內皮細胞所處的高糖微環(huán)境。本細胞藥物篩選模型具有成本低、效率高、周期短的特點,并且可重復性好,操作性強。故可以用作篩選動物模型的補充模型。

[1] 燕建鋒.高糖誘導人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)損傷及丹參多酚酸鹽對其保護作用的實驗研究[J].揚州大學,2009.

[2] 李賽美,凌家杰,王志高.加味桃核承氣湯及其拆方對高糖誘導HUVEC損傷培養(yǎng)液中ET-1、NO及ICAM-1含量的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2007,30(8):535-538.

[3] 王玉風,楊俠,董曉光.玻連蛋白對高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞的作用[J].中華實驗眼科雜志,2013,31(1):49-54.

Acellmodelfordiabeticretinopathyresearchunderhigh-glucosestimulation

GAO Na1,TAO Zheng2,DUAN Junguo2

(1.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu Sichuan,610075;2.Ophthalmic College,Chengdu University of TCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo establish a cell model for diabetic retinopathy research under high-glucose stimulation.MethodsDifferent glucose concentration(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)were co-cultured with human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).MTT and the concentration of glucose in supernatant were observed at 6h、12h、24h、48h、72h respectively.ResultsThe inhibitory rate under high-glucose stimulation on HUVEC increased with the increase of glucose concentration.HUVEC co-cultured with 30 mmol/L and 35 mmol/L glucose for 48h and longer had significant inhibitory rate(Plt;0.01).Meanwhile,the glucose concentration decreased obviously in 30mmol/L group at 48h and 72h.Conclusion30mmol/L high-glucose concentration is the optimal concentration of HUVEC for DR research,and the 48h is the best time to observe the effect of drug intervention.

Diabetic retinopathy; Cell model under high-glucose stimulation; Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.03.004

R774

1.610075,四川成都,成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院;2.610075,四川成都，成都中醫(yī)藥大學眼科學院

高娜,E-mail:gaonazsu@126.com