任娜娜，趙晨偉，唐年初(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122)

木糖醇月桂酸單酯的酶法制備工藝研究

任娜娜，趙晨偉，唐年初
(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122)

研究了以木糖醇和月桂酸為原料，在固定化脂肪酶Novozym 435的催化下合成木糖醇月桂酸單酯?？疾炝怂岽寄柋?、脂肪酶添加量、溶劑添加量、分子篩添加量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溶劑為叔丁醇、酸醇摩爾比1∶2、溶劑添加量20 mL/mmol(以月桂酸物質(zhì)的量計)、脂肪酶添加量10 g/L、分子篩添加量80 g/L、反應(yīng)溫度85 ℃、反應(yīng)時間4 h，在此條件下月桂酸轉(zhuǎn)化率為91.8%。通過紅外光譜和質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，產(chǎn)物為木糖醇月桂酸單酯。

木糖醇；月桂酸；木糖醇月桂酸單酯；脂肪酶；結(jié)構(gòu)鑒定

糖醇酯分子中同時具有親油和親水基團(tuán)，是一類典型的非離子型表面活性劑[1]。與離子型表面活性劑相比，糖醇酯除具有優(yōu)良的表面活性外，還具有易生物降解性、良好的生物相容性、無刺激及無毒性等特點，且能用可再生的資源以清潔的方法制備，是一類對環(huán)境友好的表面活性劑[2]。此外，一些糖醇酯及其衍生物還具有抑菌、抗病毒及抗腫瘤等生物活性[3]。糖醇酯應(yīng)用廣泛，可作為乳化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、分散劑、黏結(jié)劑、洗滌劑和增泡劑等應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、洗滌劑和化工等行業(yè)中[4-6]，在人類生活中發(fā)揮著越來越廣泛的作用。隨著糖醇酯新的理化性質(zhì)及生物特性的發(fā)現(xiàn)，其應(yīng)用前景愈發(fā)廣闊。現(xiàn)在，商業(yè)化的糖醇酯多通過化學(xué)方法合成，通常存在反應(yīng)條件劇烈、副反應(yīng)多、產(chǎn)品難分離純化、產(chǎn)品色澤較深、污染大、能耗高等弊端，增加了生產(chǎn)成本[7-8]。隨著人們對天然、綠色添加劑的青睞，溫和可控、選擇性高的酶促合成方法已成為研究的熱點[9]。

本文利用脂肪酶Novozym 435為催化劑合成木糖醇月桂酸單酯，并對影響反應(yīng)的主要因素(酸醇摩爾比、脂肪酶添加量、溶劑添加量、分子篩添加量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度)進(jìn)行考察，確定最佳的合成工藝，并利用紅外光譜和質(zhì)譜對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，以期為木糖醇月桂酸單酯連續(xù)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

木糖醇、月桂酸、叔丁醇、正己烷、氯化鈉，分析純；甲醇，色譜純；4 ?分子篩；脂肪酶 Novozym 435：諾維信中國生物技術(shù)有限公司。

ZKXF型真空干燥箱；TG18G臺式高速離心機(jī)；Waters Platforn ZMD 4000質(zhì)譜儀：美國 Waters 公司；Nicolet Nexus 470 FTIR傅里葉紅外光譜儀：美國Thermo Electron公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無水溶劑的制備

參照胡佳文[10]制備山梨醇脂肪酸酯的方法制備無水溶劑。將4 ?分子篩置于馬弗爐中，250℃活化6 h，取出冷卻，置于干燥器中待用。取適量的活化分子篩加到叔丁醇中，脫水48 h，以制備無水溶劑。

1.2.2 木糖醇月桂酸單酯的制備

稱取一定量的木糖醇和月桂酸溶于叔丁醇無水溶劑中，置于50℃的恒溫水浴中振蕩(300 r/min)預(yù)熱30 min，然后加入固定化脂肪酶和4 ?分子篩，于一定溫度下反應(yīng)一定時間[6]。反應(yīng)結(jié)束后，停止加熱，過濾除去脂肪酶、4 ?分子篩，飽和食鹽水洗去未反應(yīng)的木糖醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，通過正己烷離心除去產(chǎn)物中剩余的月桂酸，真空干燥得樣品，備用。

1.2.3 定量分析及計算

參照彭冬梅等[11]及Adnani等[12]的方法，略有改動。以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定反應(yīng)液，按下式以月桂酸的減少量計算月桂酸轉(zhuǎn)化率。

100%

式中：m為月桂酸的質(zhì)量，g；M月桂酸為月桂酸的摩爾質(zhì)量，200 g/mol；CNaOH為NaOH溶液的濃度，mol/L；VNaOH為滴定反應(yīng)中消耗的NaOH溶液的體積，mL。

1.2.4 定性分析

1.2.4.1 紅外光譜分析(FTIR)

采用KBr壓片法，對木糖醇月桂酸單酯進(jìn)行FTIR分析，掃描次數(shù)64次，掃描范圍為4 000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.4.2 質(zhì)譜分析(MS)

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源，離子方式ES+，電噴霧電壓3.50 kV，錐孔電壓20 V，離子源溫度120℃，碰撞能量20 eV，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～1 000，脫溶劑氣流速500 L/h。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸醇摩爾比對反應(yīng)的影響

在月桂酸添加量1.5 mmol、溶劑添加量16.7 mL/mmol(以月桂酸物質(zhì)的量計，下同)、脂肪酶添加量8 g/L、分子篩添加量55 g/L、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間4 h的條件下，改變木糖醇的添加量，考察酸醇摩爾比對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酸醇摩爾比對反應(yīng)的影響

由圖1可以看出，酸醇摩爾比對月桂酸轉(zhuǎn)化率的影響很大，在酸醇摩爾比為1∶2時，月桂酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為64.9%。這可能是由于月桂酸過多導(dǎo)致傳質(zhì)產(chǎn)生阻力，使月桂酸轉(zhuǎn)化率較低，且過量的月桂酸會使產(chǎn)物不斷向二酯甚至多酯轉(zhuǎn)化，不利于木糖醇月桂酸單酯的合成，因此應(yīng)選擇較高的酸醇摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，但發(fā)現(xiàn)酸醇摩爾比大于1∶2后，月桂酸轉(zhuǎn)化率略有下降。因此，選擇酸醇摩爾比1∶2，即木糖醇添加量3 mmol進(jìn)行反應(yīng)。

2.2 脂肪酶添加量對反應(yīng)的影響

在月桂酸添加量1.5 mmol、木糖醇添加量3 mmol、溶劑添加量16.7 mL/mmol、分子篩添加量55 g/L、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間4 h的條件下，考察脂肪酶添加量對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖 2所示。

圖2 脂肪酶添加量對反應(yīng)的影響

由圖2可以看出，脂肪酶添加量在4～10 g/L時，月桂酸轉(zhuǎn)化率隨脂肪酶添加量的增加而增大，但脂肪酶添加量增加到10 g/L后，轉(zhuǎn)化率變化趨于平緩。當(dāng)脂肪酶添加量為10 g/L時，催化效果最好，月桂酸轉(zhuǎn)化率為59.7%。這是因為反應(yīng)初始階段，底物充足，脂肪酶濃度越高，反應(yīng)速率越快，產(chǎn)物的生成速率越大，月桂酸轉(zhuǎn)化率越高。但是當(dāng)反應(yīng)趨于平衡時，在相同條件下，增加脂肪酶的添加量，反應(yīng)速率不會再增大，因此月桂酸轉(zhuǎn)化率趨于平緩。

2.3 溶劑添加量對反應(yīng)的影響

在月桂酸添加量1.5 mmol、木糖醇添加量3 mmol、脂肪酶添加量8 g/L、分子篩添加量55 g/L、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間4 h的條件下，考察溶劑添加量對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖 3所示。

圖3 溶劑添加量對反應(yīng)的影響

由圖3可以看出，隨著溶劑添加量的增加，月桂酸轉(zhuǎn)化率明顯提高。當(dāng)溶劑添加量為 20 mL/mmol時，月桂酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為63.8%。這是因為過少的溶劑量會使反應(yīng)在比較黏稠的狀態(tài)下進(jìn)行，而且不利于脂肪酶的催化反應(yīng)效果。而過量的溶劑會破壞脂肪酶的結(jié)構(gòu)，使酶活性降低，從而使酶的催化效率降低。故在本實驗中適宜的溶劑添加量為20 mL/mmol，此時反應(yīng)混合物處于良好的流動狀態(tài)及較高的酶催化效率，月桂酸轉(zhuǎn)化率也較高。

2.4 分子篩添加量對反應(yīng)的影響

在月桂酸添加量1.5 mmol、木糖醇添加量3 mmol、溶劑添加量16.7 mL/mmol、脂肪酶添加量8 g/L、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間4 h的條件下，考察分子篩添加量對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖 4所示。

圖4 分子篩添加量對反應(yīng)的影響

由圖4可以看出，分子篩添加量影響月桂酸轉(zhuǎn)化率。分子篩添加量由20 g/L增加到100 g/L時，月桂酸轉(zhuǎn)化率由47.8%快速增大到66.4%，分子篩添加量大于100 g/L時，月桂酸轉(zhuǎn)化率降低。這是因為添加分子篩會快速吸附酯化反應(yīng)所生成的水，使反應(yīng)正向進(jìn)行，轉(zhuǎn)化率升高；但分子篩過量，會爭奪酶催化合成所必需的水分，導(dǎo)致脂肪酶部分失活，因此高濃度的分子篩會使月桂酸轉(zhuǎn)化率降低。該實驗結(jié)果和Lozano等[13]的研究結(jié)果類似。同時發(fā)現(xiàn)，分子篩添加量為80 g/L時的月桂酸轉(zhuǎn)化率與100 g/L的差不多，因此從成本等方面綜合考慮，選擇80 g/L作為最佳分子篩添加量。

2.5 反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響

在月桂酸添加量1.5 mmol、木糖醇添加量3 mmol、溶劑添加量16.7 mL/mmol、脂肪酶添加量8 g/L、分子篩添加量55 g/L、反應(yīng)溫度55℃的條件下，考察反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響

由圖5可以看出，月桂酸轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時間的延長先增大后減小。反應(yīng)時間在4 h時月桂酸轉(zhuǎn)化率最高，為59.4%。這可能是由于在反應(yīng)初始階段，主要發(fā)生酯化反應(yīng)，月桂酸轉(zhuǎn)化率升高。隨著反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行，酯化反應(yīng)生成的副產(chǎn)物水增加到一定濃度，逆反應(yīng)速率加快，造成轉(zhuǎn)化率降低。

2.6 反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響

在月桂酸添加量1.5 mmol、木糖醇添加量3 mmol、溶劑添加量20 mL/mmol、脂肪酶添加量10 g/L、分子篩添加量80 g/L、反應(yīng)時間4 h的條件下，考察反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響

由圖6可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度從55℃逐漸升高到85℃時，月桂酸轉(zhuǎn)化率顯著提高，85℃時轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為91.8%，這是因為反應(yīng)溫度升高，酶活力增大，反應(yīng)速率加快，轉(zhuǎn)化率升高；隨后隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，月桂酸轉(zhuǎn)化率開始下降。這是由于隨反應(yīng)溫度的不斷升高，部分脂肪酶變性失活導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。故本實驗選擇85℃作為反應(yīng)的最適溫度。

2.7 定性分析

圖7 木糖醇月桂酸單酯的FTIR圖

木糖醇月桂酸單酯的質(zhì)譜圖如圖8所示。由圖8可以看出，產(chǎn)物離子峰m/z為357.0[M+Na]+和m/z為691.1[2M+Na]+，而木糖醇月桂酸單酯的相對分子質(zhì)量為334，故判斷質(zhì)譜上的離子峰分別為1個木糖醇月桂酸單酯的離子結(jié)合1個Na+及2個木糖醇月桂酸單酯的離子結(jié)合1個Na+。即產(chǎn)物為木糖醇月桂酸單酯。這一結(jié)果與麥芽糖醇脂肪酸酯的酶催化合成[5]及甘露醇辛酸二酯的酶法合成[15]中的質(zhì)譜結(jié)果類似。

圖8 木糖醇月桂酸單酯的質(zhì)譜圖

3 結(jié) 論

采用固定化脂肪酶Novozym 435催化木糖醇和月桂酸合成木糖醇月桂酸單酯的最佳條件為反應(yīng)溶劑為叔丁醇、酸醇摩爾比1∶2、溶劑添加量20 mL/mmol、脂肪酶添加量10 g/L、分子篩添加量80 g/L、反應(yīng)溫度85℃、反應(yīng)時間4 h，在此條件下月桂酸轉(zhuǎn)化率為91.8%。通過傅里葉紅外光譜與質(zhì)譜分析表明，合成的產(chǎn)物為木糖醇月桂酸單酯。

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Enzymaticpreparationofmonolauroylxylitol

REN Nana, ZHAO Chenwei, TANG Nianchu
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

The monolauroyl xylitol was synthesized from xylitol and lauric acid with Novozym 435 as catalyst. The effects of molar ratio of lauric acid to xylitol, dosage of lipase, dosage of solvent, dosage of molecular sieve, reaction time and reaction temperature on the reaction were investigated and the reaction conditions were optimized. The results showed that the optimal reaction conditions were obtained as follows: withtert-butyl alcohol as solvent, molar ratio of lauric acid to xylitol 1∶2, dosage of lipase 10 g/L, dosage of solvent 20 mL/mmol(based on amount of lauric acid), dosage of molecular sieve 80 g/L, reaction time 4 h and reaction temperature 85℃. Under these conditions, the conversion rate of lauric acid was 91.8%. The product was identified as monolauroyl xylitol by infrared spectroscopy and mass spectrometry.

xylitol; lauric acid; monolauroyl xylitol; lipase; structure identification

2017-01-10；

2017-06-17

任娜娜(1991)，女，碩士研究生，主要從事油脂方面的研究工作(E-mail)15505296883@163.com。

唐年初，副教授，博士(E-mail)tangnc@126.com。

油脂化學(xué)

TS202.3;Q814.4

A

1003-7969(2017)10-0039-04