孫德偉，李 波，陳洪建，李進(jìn)偉，曹培讓，劉元法(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

油脂加工

南極磷蝦脂質(zhì)的亞臨界提取及磷脂分析

孫德偉，李 波，陳洪建，李進(jìn)偉，曹培讓，劉元法
(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

研究了南極磷蝦脂質(zhì)的亞臨界丁烷提取工藝。測(cè)定了南極磷蝦脂質(zhì)的酸值、過(guò)氧化值、氟含量、生育酚含量、蝦青素含量、磷脂含量及磷脂種類組成、脂肪酸組成。結(jié)果表明，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)的較佳工藝條件為：動(dòng)態(tài)提取時(shí)間120 min(單次提取時(shí)間30 min、提取4次)、提取壓力1.0 MPa、提取溫度40℃；在較佳工藝條件下南極磷蝦脂質(zhì)提取率為21.39%；提取的南極磷蝦脂質(zhì)的酸值(KOH)10.6 mg/g，過(guò)氧化值3.01 meq/kg，蝦青素含量248.4 mg/kg，生育酚含量67.7 mg/kg，磷脂含量28.68%，其中磷脂中磷脂酰膽堿占71.20%；磷脂酰膽堿中脂肪酸組成與甘三酯的基本一致，但磷脂酰膽堿中EPA和DHA含量明顯高于甘三酯的。

亞臨界丁烷；南極磷蝦；脂質(zhì)；脂肪酸；磷脂

南極磷蝦是具有世界上最大生物量的物種之一，可作為海鮮被直接食用，也可以作為魚類食物或添加劑，但更為重要的是用于提取南極磷蝦脂質(zhì)等工業(yè)深加工的原料[1-2]。南極磷蝦含水77.9%～83.1%、脂質(zhì)0.4%～3.6%、蛋白質(zhì)11.9%～15.4%，以及2.0%的甲殼素[3]。南極磷蝦脂質(zhì)富含n-3多不飽和脂肪酸(EPA和DHA)、磷脂和蝦青素等功能性成分[4]。因此，南極磷蝦及其脂質(zhì)的開發(fā)和利用近年來(lái)受到廣泛的研究。

南極磷蝦脂質(zhì)提取的原料有新鮮蝦、冷凍蝦、冷凍干燥蝦或蝦粉，脂質(zhì)的提取方法主要包括溶劑提取和無(wú)溶劑提取。就溶劑提取而言，南極磷蝦脂質(zhì)通常由單一溶劑如丙酮、乙醇、正己烷等提取，但該法存在耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、效率不高、溶劑污染及物料中生物活性物質(zhì)易被破壞等缺點(diǎn)。另有研究采取先丙酮后乙醇兩步法溶劑提取[5-6]，但兩步法提取耗時(shí)較長(zhǎng)、工業(yè)脫溶分離技術(shù)成本高。部分學(xué)者采用超臨界二氧化碳夾帶20%乙醇提取[7]，但該方法提取之前需要先進(jìn)行干燥，高溫可能破壞南極磷蝦中熱敏成分。無(wú)溶劑提取有酶法提取[8]、超臨界流體提取[9]等，但存在費(fèi)用高問(wèn)題。因此，目前亟需尋求一種經(jīng)濟(jì)、污染低和對(duì)脂質(zhì)成分破壞性低的提取方法。

亞臨界流體提取技術(shù)因其提取時(shí)壓力低、溫度低、效率高以及投資低，已被廣泛應(yīng)用于植物脂質(zhì)[10-12]和動(dòng)物脂質(zhì)[13-14]的提取。亞臨界流體提取技術(shù)應(yīng)用于南極磷蝦脂質(zhì)的提取可以最大程度地減少氧化的發(fā)生，保護(hù)多不飽和脂肪酸、蝦青素和生育酚等生物活性物質(zhì)。本文以冷凍干燥南極磷蝦為原料，采用亞臨界流體丁烷提取技術(shù)分離制備南極磷蝦脂質(zhì)并檢測(cè)其基本物性指標(biāo)。利用硅膠柱層析對(duì)南極磷蝦中的磷脂進(jìn)行了分離；采用高效液相色譜對(duì)分離的磷脂組成進(jìn)行分析，并采用氣相色譜對(duì)甘三酯和磷脂酰膽堿的脂肪酸組成進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

冰凍南極磷蝦，實(shí)驗(yàn)室冷凍干燥后粉碎過(guò)40目篩，-40℃保存?zhèn)溆?。脂肪酸、磷脂、生育酚?biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)西格瑪公司；CBE-5L亞臨界丁烷提取裝置：河南亞臨界生物技術(shù)有限公司；1100高效液相色譜儀、7820A氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦及其脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)分析

南極磷蝦水分(GB 5009.3—2010)、蛋白質(zhì)(GB 5009.5—2010)、脂肪(GB/T 5009.6—2003)、灰分(GB 5009.4—2010)、氟元素(GB/T 5009.18—2003)、其他微量元素[15]，脂質(zhì)酸值(AOCS Cd 3d-63)、過(guò)氧化值(AOCS Cd 8-53)、生育酚含量(AOCS Ce 8-89)、氟含量(GB/T 5009.18—2003)、磷脂含量(AOCS Ja 7-86)和蝦青素含量[16]參照相應(yīng)方法測(cè)定。

1.2.2 亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)

工藝如下：冰凍南極磷蝦→冷凍干燥(水分約8.0%)→粉碎過(guò)40目篩→亞臨界丁烷提取。亞臨界丁烷提取具體如下：將500 g南極磷蝦粉用布袋封口放入提取罐，抽真空。按照料液比1∶5將亞臨界丁烷泵入提取罐，外套熱水循環(huán)控制提取溫度，設(shè)定條件提取完成后將提取混合液導(dǎo)入分離罐減壓蒸發(fā)分離目標(biāo)物。多次提取后合并提取物,離心過(guò)濾稱重?？傊|(zhì)提取率=提取的脂質(zhì)質(zhì)量/物料質(zhì)量×100%。

1.2.3 南極磷蝦磷脂分離及分析

薄層色譜(TLC)進(jìn)行磷脂分離，硅膠板，展開劑氯仿-丙酮-甲醇-乙酸-水(體積比50∶20∶10∶10∶5)，刮板溶于氯仿提取后高效液相色譜(HPLC)分析，以氯仿-甲醇-水(體積比70∶30∶1)作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量。

1.2.4 脂肪酸組成分析

樣品按Tang等[3]方法甲酯化，氣相色譜(GC)檢測(cè)。分析條件：初溫60℃，保持3 min, 以5℃/min 升溫至175℃，以2℃/min升溫至220℃后保持；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度150℃；整個(gè)分析過(guò)程為70 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦基本組分

本實(shí)驗(yàn)采用低溫空氣自然解凍樣品，對(duì)冰凍南極磷蝦的基本指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定,并檢測(cè)了南極磷蝦中部分微量元素含量，結(jié)果見表1。

表1 南極磷蝦部分微量元素含量(濕基) mg/kg

南極磷蝦(濕基)含水80%、蛋白質(zhì)12%、脂肪4.9%、灰分3%，以及豐富的鐵、鋅、硒等對(duì)人體有益的微量成分。由表1可知，南極磷蝦(濕基)氟元素含量1 520 mg/kg，該結(jié)果與張海生等[17]報(bào)道的1 232 mg/kg 相近。南極磷蝦主要成分隨捕撈季節(jié)、性別、生長(zhǎng)周期等有較大變化[18]。趙玲等[15]測(cè)定了南極磷蝦20 種元素含量，結(jié)果顯示鈣、鈉、鉀、鎂、鐵、鋅和硒等含量較高，鈷、鎳、鉻、鎘和鉛等含量較低。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的微量元素含量結(jié)果與趙玲等[15]的檢測(cè)結(jié)果基本一致。

2.2 亞臨界丁烷提取條件確定

2.2.1 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

在提取溫度40℃、單次提取時(shí)間30 min、提取壓力1.0 MPa的條件下,考察不同提取次數(shù)對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取次數(shù)對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響

由圖1可知，隨著提取次數(shù)的增加，提取率呈增加趨勢(shì)。從提取1次增至4次提取率增加明顯，達(dá)到21.23%，從提取4次增至6次，動(dòng)態(tài)提取時(shí)間由120 min增至180 min，提取率基本不變。基于簡(jiǎn)化操作流程、增加效率考慮，提取次數(shù)確定為4次。

2.2.2 單次提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在提取溫度40℃、提取壓力1.0 MPa、提取4次的條件下，考察不同單次提取時(shí)間對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 單次提取時(shí)間對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，隨著單次提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率呈增加趨勢(shì)。單次提取時(shí)間由10 min延長(zhǎng)至30 min時(shí)，提取率增至21.33%。隨后單次提取時(shí)間逐漸延長(zhǎng)至50 min，提取率增加不明顯。提取次數(shù)和單次提取時(shí)間關(guān)聯(lián)度較大，動(dòng)態(tài)提取時(shí)間120 min，絕大部分脂質(zhì)被提取出來(lái)(見圖1)。若減少提取次數(shù)，延長(zhǎng)單次提取時(shí)間，由于脂質(zhì)在溶劑中存在飽和度，其效果不如更換新溶劑進(jìn)行提取。綜上，選擇單次提取時(shí)間30 min，動(dòng)態(tài)提取時(shí)間120 min作為本實(shí)驗(yàn)較佳條件。

2.2.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

在提取壓力1.0 MPa、動(dòng)態(tài)提取時(shí)間120 min(單次提取時(shí)間30 min，提取4次)條件下，考察不同提取溫度對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著提取溫度升高，提取率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度由30℃升至40℃，提取率迅速增加至21.22%，繼續(xù)升高提取溫度，提取率基本保持不變。這是由于溫度升高使亞臨界丁烷的揮發(fā)性和擴(kuò)散系數(shù)增大，可更好溶解脂質(zhì)從而增加提取率；但在其他因素如提取壓力、提取時(shí)間、提取次數(shù)不變的情況下，提取溫度升高丁烷分子運(yùn)動(dòng)加速導(dǎo)致了其密度有所降低，對(duì)提取率有負(fù)面影響。此外，提取溫度升高還會(huì)加速脂質(zhì)中蝦青素、生育酚、多不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)的分解，故提取溫度宜選擇40℃。

圖3 提取溫度對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響

2.2.4 提取壓力對(duì)提取率的影響

在提取溫度40℃、動(dòng)態(tài)提取時(shí)間120 min(單次提取30 min，提取4次)條件下，考察不同提取壓力對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取壓力對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響

由圖4可知，隨著提取壓力增大，提取率呈增加趨勢(shì)。當(dāng)提取壓力由0.6 MPa升高至1.0 MPa時(shí)提取率迅速增加，當(dāng)提取壓力繼續(xù)增加時(shí)提取率基本不變。這是因?yàn)閬喤R界狀態(tài)下丁烷擴(kuò)散性高、黏度低利于提取，但提取壓力增大達(dá)到一定值后，提取罐內(nèi)溶劑與溶質(zhì)作用趨于平衡，提取率不再增加。此外，更高的提取壓力也意味著更多的能量消耗，會(huì)增加設(shè)備運(yùn)行成本。因此，提取壓力確定為1.0 MPa。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定較佳亞臨界丁烷提取條件為：動(dòng)態(tài)提取時(shí)間120 min(單次提取時(shí)間30 min、提取4次)，提取溫度40℃，提取壓力1.0 MPa。在較佳提取條件下，南極磷蝦脂質(zhì)提取率可達(dá)21.39%。

在較佳條件下提取的南極磷蝦脂質(zhì)酸值(KOH)(10.6 mg/g)和過(guò)氧化值(3.01 meq/kg)較高。比較了不同批次提取的南極磷蝦脂質(zhì)，其變化較大，這可能是因?yàn)樵显趦?chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程中，部分脂質(zhì)被氧化成游離脂肪酸的緣故。亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)氟含量為1.5 mg/kg，低于我國(guó)對(duì)水產(chǎn)中氟元素限量2.0 mg/kg的要求(GB 2762—2005)，可見氟元素主要?dú)埩粼谔嵊辔镏小喤R界丁烷制備的南極磷蝦脂質(zhì)中主要抗氧化性物質(zhì)蝦青素和生育酚含量分別為248.4 mg/kg和67.7 mg/kg。

2.3 亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)中磷脂分析

亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)中含有豐富的磷脂，通過(guò)TLC及HPLC對(duì)磷脂的種類組成和含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見表2。

表2 亞臨界丁烷提取脂質(zhì)中甘三酯及磷脂組成 %

由表2可知，亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)主要為甘三酯和磷脂，有3種磷脂被檢出，其中磷脂酰膽堿占71.20%。曹文靜等[19]采取正己烷無(wú)水乙醇混合溶劑提取的南極磷蝦脂質(zhì)中磷脂含量為29.13%，與本實(shí)驗(yàn)提取的南極磷蝦脂質(zhì)中的磷脂含量相近。

為進(jìn)一步了解亞臨界丁烷提取的南極磷蝦脂質(zhì)中的磷脂，利用GC對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)中的甘三酯和磷脂中最主要成分磷脂酰膽堿的脂肪酸組成分別進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見表3。

表3 亞臨界丁烷提取脂質(zhì)中甘三酯及磷脂酰膽堿脂肪酸組成及含量 %

由表3可知，南極磷蝦脂質(zhì)的甘三酯和磷脂酰膽堿的脂肪酸組成基本一致，均主要由C16∶0、C18∶1、C20∶5(EPA)、C22∶6(DHA)組成。磷脂酰膽堿的脂肪酸中多不飽和脂肪酸高于甘三酯的，其中EPA和DHA總含量高約11個(gè)百分點(diǎn)。

由此可見，亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)具有較高的磷脂含量，其磷脂以磷脂酰膽堿為主，磷脂酰膽堿中EPA和DHA總含量達(dá)到了40.81%。這說(shuō)明該法提取的南極磷蝦脂質(zhì)具有很好的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

研究了南極磷蝦脂質(zhì)的亞臨界丁烷提取工藝，探討提取次數(shù)、單次提取時(shí)間、提取溫度及提取壓力對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)提取率的影響。采用硅膠柱層析及薄層色譜技術(shù)對(duì)磷脂進(jìn)行了分離，利用高效液相色譜、氣相色譜進(jìn)一步對(duì)磷脂種類組成及脂肪酸組成進(jìn)行分析。結(jié)果表明，亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)的較佳工藝條件為：動(dòng)態(tài)提取時(shí)間120 min(單次提取時(shí)間30 min，提取4次)，提取溫度40℃,提取壓力1.0 MPa；在較佳工藝條件下南極磷蝦脂質(zhì)提取率達(dá)21.39%。亞臨界丁烷提取的南極磷蝦脂質(zhì)中磷脂含量較高，其中磷脂酰膽堿占71.20%。亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)甘三酯和磷脂酰膽堿的脂肪酸組成基本一致，但磷脂酰膽堿中EPA和DHA含量明顯高于甘三酯的。

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SubcriticalbutaneextractionofAntarctickrilllipidandphospholipidsanalysis

SUN Dewei, LI Bo, CHEN Hongjian, LI Jinwei, CAO Peirang, LIU Yuanfa
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

The subcritical butane extraction process of Antarctic krill lipid was studied, and the acid value, peroxide value, fluoride content, tocopherol content, astaxanthin content, phospholipid content and phospholipid species composition, fatty acid composition of Antarctic krill lipid were determined. The results showed that the better subcritical butane extraction conditions of Antarctic krill lipid were obtained by single factor experiment as follows: dynamic extraction time 120 min (single extraction time 30 min, extraction for four times), extraction pressure 1.0 MPa and extraction temperature 40℃. Under the better extraction conditions, the extraction rate of Antarctic krill lipid was 21.39%, and the acid value, peroxide value, astaxanthin content, tocopherol content and phospholipid content were 10.6 mgKOH/g, 3.01 meq/kg, 248.4 mg/kg, 67.7 mg/kg and 28.68%, respectively. The phosphatidylcholine (PC) accounted for 71.20% of phospholipid. The fatty acid composition in triglycerides (TAG) was almost the same as that in PC, but EPA content and DHA content in PC were significantly higher than that in TAG.

subcritical butane; Antarctic krill; lipid; fatty acid; phospholipid

2017-01-11；

2017-06-16

國(guó)家自然科學(xué)基金(31671786、31571878)；國(guó)家“十三五”重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(2016YFD0401404)；蘇北科技專項(xiàng)(BN2016137)

孫德偉(1980)，男，助理研究員，在讀博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程(E-mail)sundewei1912@163.com。

劉元法，教授，博士生導(dǎo)師(E-mail)yfliu@jiangnan.edu.cn。

TS224;TQ644

A

1003-7969(2017)10-0001-05