馬素梅，曹 鈺，宋春艷，羅 煒，李珍益(1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 141； .江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 ，江蘇 無錫 141)

利用木糖產(chǎn)油脂酵母的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

馬素梅1,2，曹 鈺1,2，宋春艷2，羅 煒2，李珍益2
(1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122； 2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 ，江蘇 無錫 214122)

采用磷酸香蘭素比色法從環(huán)境中篩選分離得到1株能夠利用木糖產(chǎn)油脂的114號酵母菌株，通過生理生化特性實驗及分子生物學(xué)實驗對該菌株進行鑒定，并對該菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，考察了培養(yǎng)時間、接種量、裝液量和發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)油能力的影響，通過GC-MS對該菌株最優(yōu)發(fā)酵條件下所產(chǎn)油脂進行脂肪酸組成分析。結(jié)果表明：該菌株為膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginous)，在啤酒糟酶解液中培養(yǎng)狀況良好；最優(yōu)發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間5 d，接種量12%，裝液量30 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度32℃。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別為16.92、4.44 g/L和26.22%。所產(chǎn)油脂中不飽和脂肪酸含量76.923%，油酸含量59.087%，與植物油類似。

膠紅酵母；木糖；鑒定；微生物油脂；優(yōu)化

伴隨著世界范圍內(nèi)原油儲量的日益下降，全球氣候變暖效應(yīng)日趨嚴重，迫切需要一種能夠再生的清潔能源來取代化石燃料[1]。生物柴油具有較高的熱值，且污染小，較化石燃料安全性高，已經(jīng)成為當(dāng)前最有潛力的替代能源。目前，市場上70%～75%的生物柴油的原料都來自餐飲業(yè)廢棄油、植物油、動物脂肪，生產(chǎn)成本較高，可行性較差[2]。微生物具有生長周期短、不受氣候限制、易于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，所以通過產(chǎn)油微生物積累微生物油脂是過去利用大豆等油料作物生產(chǎn)生物柴油的良好替代品。美國國家可再生能源實驗室的報告特別指出微生物油脂將是生物柴油產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟的重要研究方向[3]。中國科學(xué)院大連化物所生物技術(shù)部也進行了產(chǎn)油菌種培育和篩選方面的研究工作，并取得了一定的效果[4-5]。目前，已知的多種產(chǎn)油微生物都只能利用葡萄糖生產(chǎn)油脂，通過這種方式生產(chǎn)生物柴油增加了經(jīng)濟成本，限制了微生物油脂的發(fā)展[6]。能否釆用廉價的原料降低成本是油脂生產(chǎn)能否規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素之一[7]。天然木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，在大米草、甘蔗渣和啤酒糟這些生物質(zhì)中半纖維素含量高于纖維素[8-10]，D-木糖作為半纖維素水解的主要產(chǎn)物，若能加以利用，必然會增加經(jīng)濟效益。近年來，關(guān)于產(chǎn)油脂微生物如微藻、紅酵母、絲狀真菌等的研究主要側(cè)重葡萄糖作為碳源的研究[11-13]，也有一些利用木糖的研究報道[4,8-9]。開發(fā)微生物油脂作為生物柴油的生產(chǎn)原料，特別是采用來源廣泛的木質(zhì)纖維素作為碳源生產(chǎn)微生物油脂，將具有一定的現(xiàn)實意義。

本研究旨在篩選1株能利用木糖產(chǎn)油脂的酵母，并利用預(yù)處理啤酒糟的水解糖發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂，對該菌株的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，為啤酒糟酶解液發(fā)酵生產(chǎn)油脂奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

菌種：實驗室保藏的產(chǎn)色素酵母及環(huán)境中篩選所得的酵母菌株共計138株；啤酒糟：青島啤酒提供，并經(jīng)過一定預(yù)處理后備用；纖維素酶：白銀賽諾生物科技有限公司提供，酶活156 U/g。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L， pH自然；

限氮培養(yǎng)基[14]：葡萄糖40 g/L，酵母膏1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，K2HPO47 g/L，NaH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH自然；

YPX培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，D-木糖20 g/L，酵母膏10 g/L，自然pH；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母膏0.5 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42 g/L，Na3C6H5O70.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH自然。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TCL-16G型臺式高速離心機，上海醫(yī)用分析儀器廠；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；PYX-DHS-50×65-B隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋；STARTER3100實驗室pH計；ZQZY-70B振蕩培養(yǎng)箱；PA2014N型電子天平0429；TU-1810型紫外可見分光光度計；BME顯微鏡；SW-CJ-ZFD潔凈工作臺；酵母基因組DNA快速抽提試劑盒，上海生物工程有限公司；Tracems氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Finnigan質(zhì)譜公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的篩選

1.2.1.1 初篩

從環(huán)境中采樣，于YPD液體培養(yǎng)基中富集過夜，稀釋適當(dāng)倍數(shù)涂布于YPD固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2 d，挑取紅色菌落，鏡檢觀察是否為酵母菌。分離到的酵母菌接種于限氮培養(yǎng)基，28℃，180 r/min，培養(yǎng)72 h，測定生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量。

1.2.1.2 木糖利用實驗

所篩酵母接種于D-木糖質(zhì)量濃度為20 g/L的YPX培養(yǎng)基，28℃，180 r/min，培養(yǎng)72 h，進行木糖利用實驗，篩選能利用木糖的酵母菌株。

1.2.1.3 啤酒糟酶解液發(fā)酵實驗

將啤酒糟以50 U/g(以底物質(zhì)量計)的比例加入纖維素酶液，緩沖液為0.05 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 4.8，加入適量青霉素抑制雜菌生長。在50℃，120 r/min 條件下酶解48 h，滅酶過濾得到啤酒糟酶解液，121℃滅菌20 min，接種產(chǎn)油效果較好且能利用木糖的幾株待測菌株32℃,180 r/min，培養(yǎng)5 d進行發(fā)酵實驗。再次篩選，最終選出性能較好的實驗菌株。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)觀察

顯微形態(tài)：挑取酵母菌培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)，吸取1滴在潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，用高倍鏡觀察酵母細胞的形態(tài)、大小和繁殖方式。

菌落形態(tài)：將新鮮培養(yǎng)的酵母菌在YPD平板上劃線，30℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落的顏色、質(zhì)地、形狀等特征。

1.2.2.2 生理生化實驗

根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]所述方法，對菌株進行糖發(fā)酵、碳/氮源同化和生長溫度實驗。

1.2.2.3 26S rDNA分析

使用酵母基因組DNA快速抽提試劑盒提取酵母的總DNA，使用通用引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACG G-3′)對菌株26S rDNA近5′端的D1/D2區(qū)域進行PCR擴增，目標(biāo)產(chǎn)物的長度大約為600 bp。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)。

1.2.3 種子液的制備

從斜面挑1環(huán)酵母到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，無菌水離心洗滌2次重懸制備種子液。

1.2.4 菌株在不同pH條件下的生長狀況

將YPD培養(yǎng)基分別用鹽酸調(diào)pH為2.0～9.5，間隔0.5個單位，裝液量30 mL/250 mL，取新鮮制備的種子液以8%的接種量接種于不同pH的YPD培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)3 d，測定生物量、油脂產(chǎn)量及油脂含量。

1.2.5 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

取新鮮制備的種子液，以不同的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在不同的發(fā)酵溫度、裝液量條件下，培養(yǎng)不同的時間，通過測定生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.6 GC-MS分析油脂脂肪酸組成

將最優(yōu)發(fā)酵條件下得到的油脂去除培養(yǎng)基組分，洗滌、離心，重復(fù)操作，直到菌泥顏色均勻無雜質(zhì)，真空冷凍干燥24 h，得到凍干菌粉。

油脂提取[16]：每克菌體加5 mL 4 mol/L的鹽酸，室溫放置30 min，沸水浴3 min，-20℃冷卻，加2倍體積的甲醇-氯仿(體積比1∶1)溶液，充分振蕩萃取，8 000 r/min，離心5 min。下層轉(zhuǎn)移至新的離心管，加等體積的0.1 mol/L 的氯化鈉溶液，振蕩離心，棄上清，蒸干得油脂。

脂肪酸甲酯化[17]：得到的干燥油脂，加2 mL 0.6 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，2 mL正己烷，劇烈振蕩2 min，30℃水浴15 min，加飽和氯化鈉溶液5 mL，靜置分層，取正己烷層用于GC-MS分析[18]。

1.2.7 生物量和油脂含量的測定

生物量：發(fā)酵液在8 000 r/min 條件下離心5 min，蒸餾水洗滌2次后收集菌體，105℃烘干至恒重，稱量并記錄數(shù)據(jù)；油脂含量：磷酸香蘭素比色法[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

2.1.1 初篩

將實驗室保藏和分離自不同環(huán)境的酵母菌138株，接種限氮培養(yǎng)基，28℃，180 r/min，搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌株的生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量。產(chǎn)油能力較好的10株菌株結(jié)果見表1。從表1可以看出，10株菌株油脂含量均大于20%，其中70號菌株油脂含量最高，達到30.29%。

表1 初篩部分結(jié)果

2.1.2 木糖的利用(見表2)

表2 木糖利用實驗結(jié)果

注：“-”表示陰性；“+”表示陽性。下同。

從表2可以看出，之前產(chǎn)油效果較好的1、2號和70號酵母在木糖作唯一碳源的YPX培養(yǎng)基中均不能正常生長，而編號25、50、53、64、66、67、114號酵母可以較好利用木糖，但這些菌株在YPX培養(yǎng)基中油脂含量顯著低于以葡萄糖為碳源的限氮培養(yǎng)基，油脂含量僅為6.61%～12.19%。綜合表1、表2的結(jié)果可知，67、114號兩株酵母的性能相對較好。

2.1.3 啤酒糟酶解液中的復(fù)篩

選擇產(chǎn)油效果較好且能利用木糖的67號和114號酵母菌株，此外考慮到在限氮培養(yǎng)時70號酵母油脂產(chǎn)量和油脂含量都是最高，將這3株酵母接種啤酒糟酶解液進行發(fā)酵實驗，再次篩選，最終選出性能較好的實驗菌株。結(jié)果見表3。

表3 啤酒糟酶解液發(fā)酵實驗結(jié)果比較

對啤酒槽酶解液中糖的分析顯示，其中含有約40%葡萄糖和60%木糖。由表3結(jié)合表1和表2可以看出，70號酵母菌雖然在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的生長和油脂含量明顯優(yōu)于67號和114號酵母菌，但由于其不能利用木糖，67號和114號酵母菌株油脂含量達到17%以上，而70號菌株在啤酒槽酶解液中的油脂含量顯著低于其他兩株酵母菌，只有10.20%。從生物量結(jié)果可以看出，114號菌株生物量最高，達到7.00 g/L，故選擇114號作為實驗菌株進行進一步研究。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

114號菌株菌落呈淺紅色，表面濕潤有光澤，邊緣較平滑，菌落易挑起。菌體細胞呈橢球形，大小為(3.6～6.6 μm)×(2～ 3.6 μm)，以出芽方式進行繁殖，見圖1，左圖為114號菌株的平板菌落形態(tài)，右圖為細胞顯微形態(tài)(100×10)。

圖1114號菌株的平板菌落形態(tài)和細胞顯微形態(tài)(100×10)

2.2.2 生理生化實驗(見表4～表6)

表4 114號菌株的碳/氮源同化實驗結(jié)果

注：W為弱陽性反應(yīng)。

表5 114號菌株的生長溫度實驗結(jié)果

表6 114號菌株的糖發(fā)酵實驗結(jié)果

注：“-”表示不發(fā)酵該糖。

從表4可以看出，114號酵母能利用組成啤酒糟中的多種單糖，木糖、阿拉伯糖、半乳糖等，是一株能利用啤酒糟半纖維素多種水解單糖組分的產(chǎn)油酵母。

通過比對《酵母菌的特征與鑒定手冊》，根據(jù)表4、表5和表6結(jié)果可初步確定114號菌株為膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginous)。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

以通用引物NL-1和NL-4擴增114號菌株26S rDNA近5′端的D1/D2區(qū)，其PCR產(chǎn)物經(jīng)體積分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳，得到片段大約為600 bp的條帶，見圖2。

圖2 114號菌株的26S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖

PCR產(chǎn)物回收后純化，由上海生物工程有限公司進行序列測定。根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI上用BLAST對擴增序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)114號菌株與Rhodotorulamucilaginous具有99%以上的同源性，親緣關(guān)系最近，與生理生化結(jié)果一致，由此可確定114號菌株為Rhodotorulamucilaginous(膠紅酵母)。

2.3 膠紅酵母菌株在不同pH條件下的生長狀況

將膠紅酵母菌株種子液以8%的接種量接種于不同pH的YPD培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)3 d，測定生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH條件下的生長結(jié)果

從圖3可以看出，膠紅酵母菌株的耐酸性較強，在pH 2.0的環(huán)境下依然可以生長良好，生物量達到近10 g/L，同時膠紅酵母菌株可生長的pH范圍很大，在pH 2.0～9.5的范圍內(nèi)均可生長，生物量都在9.5 g/L以上。與偏堿性環(huán)境相比，膠紅酵母菌株在偏酸性pH 4.0左右環(huán)境中生長較旺盛，油脂含量也較堿性條件高，這一特性對后期利用木質(zhì)纖維酶解液的發(fā)酵十分有利。

2.4 膠紅酵母菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

取新鮮制備的種子液，以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量30 mL/250 mL，28℃，180 r/min 分別培養(yǎng)2、3、4、5、6 d，測定生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量，結(jié)果見圖4。

圖4 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

從圖4可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量均呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)培養(yǎng)時間達到5 d時，生物量達到一個較高水平，油脂產(chǎn)量和油脂含量均達到最大值，所以選擇5 d為最佳培養(yǎng)時間進行進一步實驗。

2.4.2 接種量的優(yōu)化

取新鮮制備的種子液，分別以5%、8%、10%、12%、15%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量30 mL/250 mL，28℃，180 r/min培養(yǎng)5 d，測定生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量，結(jié)果見圖5。

從圖5可以看出，隨著接種量的升高，生物量、油脂產(chǎn)量及油脂含量呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)接種量達到12%時，生物量及油脂產(chǎn)量達到一個最大值，之后開始下降，所以選擇12%的接種量進行進一步實驗。

圖5 接種量的優(yōu)化

2.4.3 裝液量的優(yōu)化

取新鮮制備的種子液，以12%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量分別為20、30、40、50 mL/250 mL，28℃，180 r/min培養(yǎng)5 d，測定生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量，結(jié)果見圖6。

圖6 裝液量的優(yōu)化

從圖6可以看出，裝液量較低時，生物量、油脂產(chǎn)量及油脂含量均表現(xiàn)良好，呈現(xiàn)上升趨勢，裝液量達到30 mL/250 mL時，生物量、油脂產(chǎn)量及油脂含量達到最大。在恒定的轉(zhuǎn)速下裝液量少時供氧較好，對于好氧菌來說生長較好?？梢赃x擇裝液量30 mL/250 mL為最適裝液量。

2.4.4 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

取新鮮制備的種子液，以12%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為30 mL/250 mL，發(fā)酵溫度分別為25、28、30、32、35℃，180 r/min培養(yǎng)5 d，測定生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量，結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

從圖7可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，生物量、油脂產(chǎn)量及油脂含量呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)酵溫度30℃時，生物量達到最大值，為17.18 g/L，而油脂產(chǎn)量及油脂含量較低，32℃時，油脂產(chǎn)量和油脂含量均有所升高，分別為4.44 g/L和26.22%，生物量也維持在一個較高水平，達到16.92 g/L，繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，生物量下降，這與表5中生理生化特性相一致，因而選擇32℃為最適發(fā)酵溫度。

2.5 油脂脂肪酸組成分析(見表7)

表7 膠紅酵母菌株所產(chǎn)油脂脂肪酸組成及含量 %

從表7可以看出，膠紅酵母菌株所產(chǎn)油脂脂肪酸組成中不飽和脂肪酸含量較高，達到76.923%，不飽和脂肪酸中油酸含量最高，達到59.087%。較高的不飽和脂肪酸含量與植物油類似，可作為油料作物的替代品用于生產(chǎn)生物柴油。

3 結(jié) 論

從環(huán)境中篩選得到1株能夠利用木糖產(chǎn)油脂的114號酵母菌株，經(jīng)過經(jīng)典的形態(tài)和生理生化特性鑒定和26S rDNA分析，鑒定為膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginous)。膠紅酵母114號菌株能利用啤酒槽中的多種糖組分進行生長，對pH具有較強耐受性，可在pH 2.0～9.5范圍內(nèi)良好生長。對該菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間5 d，接種量12%，裝液量30 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度32℃。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別為16.92、4.44 g/L和26.22%。對膠紅酵母114號菌株所產(chǎn)油脂經(jīng)GC-MS分析，其不飽和脂肪酸含量76.923%，與植物油類似。由于該菌株能不同程度地利用啤酒糟酶解液里的主要單糖(葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)轉(zhuǎn)化為油脂貯存在胞內(nèi)，具備在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中進行全糖利用的潛力，為啤酒糟酶解液發(fā)酵生產(chǎn)油脂奠定了基礎(chǔ)。

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Screening,identificationandoptimizationoffermentationconditionofoleaginousyeastusingxylose

MA Sumei1,2, CAO Yu1,2, SONG Chunyan2, LUO Wei2, LI Zhenyi2
(1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122,Jiangsu, China; 2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122, Jiangsu, China)

An oleaginous yeast (strain 114) utilizing xylose was screened and isolated from nature environment by the phosphoric acid-vanillin reaction. This strain was identified based on physiological and biochemical characterization and 26S rDNA sequence analysis. The fermentation conditions of strain 114 were optimized, and the effects of culture time, inoculation amount, fermentation temperature and media amount on oil production capacity of the strain were investigated. The fatty acid composition of the obtained oil was analyzed by GC-MS. The results showed that the strain was identified asRhodotorulamucilaginous, and it grew well in enzymolysis liquid of pretreated brewer’s spent grain. The optimal fermentation conditions were obtained as follows: culture time 5 d, inoculation amount 12%, fermentation temperature 32℃ and media amount 30 mL/250 mL. Under these conditions, the biomass, oil yield and oil content were 16.92, 4.44 g/L and 26.22% respectively. The contents of unsaturated fatty acid and oleic acid were 76.923% and 59.087% respectively, which were similar to vegetable oil.

Rhodotorulamucilaginous； xylose； identification； microbial oil； optimization

2016-12-25；

2017-05-22

國家高技術(shù)研究發(fā)展863資助項目(2013AA102109)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目

馬素梅(1992)，女，碩士研究生，研究方向為木質(zhì)纖維素預(yù)處理及單細胞油脂(E-mail)m_susie@163.com。

曹 鈺，副教授(E-mail)tsaoy5@jiangnan.edu.cn。

生物工程

Q935;TQ920.1

A

1003-7969(2017)10-0115-06