郭曉燁，邱昌揚，何勇錦，陳 涵，王明茲,2，陳必鏈,2(.福建師范大學 生命科學學院，福州 3507； 2.福建師范大學 工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州 3507)

提高微綠球藻的生物量和油脂含量的研究

郭曉燁1，邱昌揚1，何勇錦1，陳 涵1，王明茲1,2，陳必鏈1,2
(1.福建師范大學 生命科學學院，福州 350117； 2.福建師范大學 工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州 350117)

研究光照強度和硝酸鉀質量濃度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響，通過兩步培養(yǎng)法培養(yǎng)微綠球藻提高其生物量和油脂含量。結果表明：在硝酸鉀質量濃度100 mg/L條件下，當光照強度為1 940～2 060 lx時，培養(yǎng)12 d，微綠球藻的生物量和油脂含量最高，分別為0.68 g/L和16.28%；低光照強度(1 940～2 060 lx)下，在不添加硝酸鉀時，微綠球藻的生物量最低，為0.39 g/L，油脂含量最高，為22.62%；隨著硝酸鉀質量濃度的增加，微綠球藻的生物量逐漸增加，而油脂含量逐漸下降；兩步培養(yǎng)法可以促進微綠球藻的油脂合成，油脂含量和油脂產量分別達到30.50%和0.15 g/L。

微綠球藻；兩步培養(yǎng)；油脂；生物量

微綠球藻是海洋經濟型產油微藻，具有油脂含量高、易培養(yǎng)、細胞壁薄、營養(yǎng)豐富等特點[1-2]。因此，利用富油微綠球藻開發(fā)生物柴油，具有廣闊的發(fā)展前景。提高微綠球藻的油脂含量和生物量的研究，主要是通過調控氮、磷、金屬離子、光照和培養(yǎng)模式等途徑。研究表明，在氮缺乏條件下，會促進微綠球藻細胞的油脂合成，但會影響微藻的生長。竇曉等[3]研究了N/P比和氮鹽濃度對眼點擬微綠球藻培養(yǎng)密度和油脂含量的影響，當培養(yǎng)基中NaNO3質量濃度為0.225 g/L、N/P比為4∶1時，生物量和油脂含量均最大，分別為2.53 g/L和41.20%。杜曉鳳等[4]通過正交實驗設計優(yōu)化氣升式反應器培養(yǎng)微綠球藻產油條件，結果表明，在光照強度為5 000 lx、光周期L∶D為10∶14、溫度24℃條件下缺氮培養(yǎng)，微綠球藻的油脂含量最高，為46.72%。

在實際生產中，微藻的生長與產油主要呈非生長相關型，即在極端條件(缺營養(yǎng)物質和/或強光)下有利于油脂積累[5]。為了提高微藻生物量和油脂產量，獲得適合微藻生物量與細胞油脂含量的平衡條件，是開發(fā)第三代微藻生物質能源的關鍵技術點。兩步培養(yǎng)法可實現(xiàn)該平衡[6]，即第一步提高生物量：在低光照強度下，在含氮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微藻到穩(wěn)定期；第二步積累油脂：離心收獲藻泥，再將其轉于缺氮培養(yǎng)基中，并置高光照強度下培養(yǎng)，脅迫其積累油脂。Mujtaba等[7]利用兩步培養(yǎng)法通過含氮培養(yǎng)基培養(yǎng)使小球藻生物量達1.87 g/L，再將其轉于缺氮條件培養(yǎng)積累油脂，使油脂含量從14.50%提高到24.60%(干重)。本課題組的李小妹等[8]采用兩步培養(yǎng)法培養(yǎng)柵藻，生物量可達0.96 g/L，油脂含量可達23.35%，生物量和油脂含量分別比常規(guī)單步法培養(yǎng)(10 d)提高了35.74%和近1倍；而采用兩步缺氮法培養(yǎng)，油脂含量可達50%左右，最高可達53%[9]。本文研究光照強度和硝酸鉀質量濃度對微綠球藻的生物量和油脂含量的影響，然后研究兩步培養(yǎng)法對微綠球藻合成油脂的影響，以期為微綠球藻的工業(yè)化應用提供基礎數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藻種

微綠球藻Nannochlorisoculata，保藏于本實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用MAV配方，組成成分為：KNO3100 mg/L，KH2PO410 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.5 mg/L，MgSO40.25 mg/L，Na2EDTA 10 mg/L，維生素B125×10-7mg/L，維生素B16×10-3mg/L，海水1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。其中，F(xiàn)eSO4·7H2O和維生素通過0.22 μm過濾除菌。

含100 mg/L KNO3的MAV培養(yǎng)基標記為MAV(+N)，缺KNO3的MAV培養(yǎng)基標記為MAV(-N)。

1.2 實驗方法

1.2.1 光照強度和硝酸鉀質量濃度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響

以20%的接種量接種于內裝MAV(+N)培養(yǎng)液120 mL的500 mL三角瓶中，設定4個光照強度范圍(1 230～1 320 lx、1 940～2 060 lx、2 440～2 720 lx和3 000～3 250 lx)和4個硝酸鉀質量濃度水平(0、50、100、150 mg/L)，130 r/min的搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，培養(yǎng)12 d，測定生物量和油脂含量。

1.2.2 兩步培養(yǎng)法

第一步(高氮培養(yǎng))：將微綠球藻接種于MAV(+N)培養(yǎng)基中，在低光照強度(1 940～2 060 lx)下?lián)u床培養(yǎng)至穩(wěn)定期(12 d)。第二步(缺氮培養(yǎng))：將藻液于5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用培養(yǎng)基MAV(-N)洗藻泥，將藻泥接種于MAV(-N)培養(yǎng)基中，于高光照強度(7 500 lx)下?lián)u床培養(yǎng)8 d。

1.2.3 兩步缺氮培養(yǎng)法

第一步(缺氮培養(yǎng))：將微綠球藻培養(yǎng)至生長對數(shù)期后，接種于MAV(-N)培養(yǎng)基中，于低光照強度(1 940～2 060 lx)下?lián)u床培養(yǎng)至穩(wěn)定期(12 d)。第二步(缺氮培養(yǎng))：將藻液于5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用培養(yǎng)基MAV(-N)洗藻泥，將藻泥接種于MAV(-N)培養(yǎng)基中，于高光照強度(7 500 lx)下?lián)u床培養(yǎng)8 d。

1.2.4 生物量測定

取一定量藻液，于4℃下16 000 r/min離心5 min，棄去上清液，蒸餾水洗滌2次，將藻泥置于80℃烘干至恒重，稱重。

1.2.5 油脂含量測定

參考Bligh等[10]方法。將150 mL藻液于10 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，蒸餾水洗滌2次，冷凍干燥后，收集藻粉。稱取50～100 mg凍干藻粉于10 mL具蓋螺口離心管中，加入5 mL 5% KOH溶液，間歇振蕩混勻20 min，70℃水浴加熱5 min，5 000 r/min離心10 min，去除含葉綠素的上清液，重復1次。加2 mL 4 mol/L鹽酸溶液，充分混勻，室溫下靜置30 min，沸水浴加熱5 min，-20℃重復速凍5次。加入3 mL氯仿-甲醇(體積比2∶1)，間歇振蕩混勻20 min，5 000 r/min離心10 min后，取氯仿層，重復3次。收集氯仿層于10 mL離心管中，加入等體積的5% NaCl溶液，充分混勻，5 000 r/min離心10 min后，收集氯仿層，真空去除氯仿，至恒重。油脂含量=油脂質量/凍干藻粉質量×100%。

1.2.6 培養(yǎng)液中硝酸鉀質量濃度的測定[11]

硝酸鉀標準曲線的制作：取6支試管，配制不同質量濃度的硝酸鉀溶液。每支試管中依次加入0.1 mL 8 g/L氨基磺酸、0.4 mL 1 mol/L鹽酸和8.5 mL蒸餾水，至溶液共10 mL，于220 nm和275 nm波長下分別測吸光值A。以硝酸鉀質量濃度為縱坐標，以吸光值(A220-2A275)為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：y=17.185(A220-2A275)-0.070 5，R2=0.999 69。

培養(yǎng)液中硝酸鉀質量濃度的測定：取1.0 mL微綠球藻培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min后，取上清培養(yǎng)基，加入0.1 mL 8 g/L氨基磺酸、0.4 mL 1 mol/L 鹽酸和8.5 mL蒸餾水。以新鮮海水為對照組，在220 nm和275 nm波長下，測吸光值。根據標準曲線方程，計算樣品中硝酸鉀的質量濃度。

1.2.7 數(shù)據處理

每組實驗數(shù)據設3個平行，采用Micro Excel 2010和Origin 8.5軟件處理數(shù)據，結果用“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與討論

2.1 光照強度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響

在硝酸鉀質量濃度為100 mg/L的條件下，考察不同光照強度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響，結果見圖1。

圖1 光照強度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響

由圖1可知，當光照強度處于1 940～2 060 lx時，微綠球藻的生物量和油脂含量都最高，分別為0.68 g/L和16.28%。當光照強度低于1 940 lx或高于2 060 lx時，微綠球藻的生物量和油脂含量較低。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，光照強度會影響新穎擬綠球藻(Pseudochlorococcumsp.)合成淀粉的關鍵酶腺苷二磷酸焦磷酸化酶(ADPase)的活性，導致微藻的生化組分存在較大差異性。Jia等[13]系統(tǒng)分析微綠球藻光固碳與油脂積累的分子機制，結果也發(fā)現(xiàn)光照強度和缺氮調控對微藻的糖類、糖脂、中性脂、磷脂合成有密切關系。Li[12]、Jia[13]等的結果表明，在適合的光照強度范圍，微藻機體光合作用代謝與細胞膜上蛋白質、單糖和生物膜磷脂的合成處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，這可提高微藻的CO2固定速率，為微藻的生長繁殖提供充足的碳源。因此，選擇1 940～2 060 lx作為培養(yǎng)微綠球藻的最適光照強度。

2.2 硝酸鉀質量濃度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響

硝酸鉀是MAV培養(yǎng)基中含量最高的營養(yǎng)料，其中氮元素是構成微藻細胞蛋白質、葉綠素的重要元素。適量的初始硝酸鉀質量濃度有利于微藻的生長和油脂的合成。低光照強度 (1 940～2 060 lx) 下考察硝酸鉀質量濃度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響，結果見圖2。

圖2 不同硝酸鉀質量濃度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響

由圖2可知，培養(yǎng)結束后，培養(yǎng)液中氮質量濃度都很低(lt;1 mg/L)。在不添加硝酸鉀時，微綠球藻的生物量最低(0.39 g/L)，但油脂含量最高(22.62%)；隨著硝酸鉀質量濃度的增加(0～100 mg/L)，微綠球藻的生物量也逐漸增加(0.39～0.66 g/L)；但微綠球藻細胞的油脂含量呈下降趨勢(22.62%～10.72%)。這與之前關于柵藻的研究結果是一致的，在氮充足條件下，有利于微藻的生長；在缺氮條件下，促進微藻油脂的大量合成[14-15]。Guschina等[14]指出培養(yǎng)基中氮元素含量會影響真核微藻光合作用中的PSⅡ表觀吸收元件，包括光合代謝的酶(如ADPase)和色素的合成。Dean等[15]也證實了Guschina等[14]的觀點。但過高的硝酸鉀質量濃度(150 mg/L)不利微藻的生長和代謝活動。這說明了微綠球藻生長和代謝活動對培養(yǎng)基中硝酸鉀質量濃度有一定的選擇性。因此，在氮充足條件(100 mg/L)下，有利于微藻的生長和糖類(如淀粉)的合成；在缺氮條件下，微藻機體的碳流量發(fā)生改變，即合成蛋白質和/或糖類的碳流量向合成油脂轉移，最終提高油脂含量。

為了獲得較高的生物量和油脂含量，尋找微藻生長與油脂合成的最佳調控點，兩步培養(yǎng)法可以克服圖2中微藻生長和油脂合成的問題。因此，在缺氮條件下，有必要進一步探索微綠球藻的油脂合成調控條件。

2.3 缺氮條件下光照強度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響

關于柵藻等其他藻種的研究表明，在缺氮條件下，高光照強度有利于微藻細胞的生長和油脂的合成。因此，在MAV(-N)培養(yǎng)基中，選擇4個光照強度培養(yǎng)12 d，測定其生物量及油脂含量，結果見圖3。

圖3 缺氮條件下光照強度對微綠球藻生物量和油脂含量的影響

由圖3可知，在7 000～7 500 lx光照強度下，微綠球藻的油脂含量(13.94%)最高，生物量(0.33 g/L)高于6 000 lx以下組和8 000～8 500 lx組，但低于硝酸鉀質量濃度為100 mg/L MAV(+N)培養(yǎng)基的生物量(0.66 g/L)。這進一步證實了氮充足和缺氮條件下，微藻的代謝活動，尤其是生長繁殖代謝影響較大。此外，在缺氮條件下，光照強度會影響微藻的生長和油脂合成。這可能是因為在缺氮下過高或過低的光照強度影響微藻的光合作用，導致固碳率降低和機體碳流量方向的轉移，影響微藻的生長和油脂合成[12-15]。為了降低能耗，選擇7 000～7 500 lx為微綠球藻在缺氮條件下的最適光照強度。

2.4 不同培養(yǎng)方法促進微綠球藻合成油脂

通過不同培養(yǎng)方法，即高氮培養(yǎng)(硝酸鉀質量濃度為100 mg/L,光照強度為1 940～2 060 lx)、兩步培養(yǎng)法和兩步缺氮培養(yǎng)法，研究微綠球藻的生物量、油脂含量和油脂產量的變化，結果見圖4。

圖4 不同培養(yǎng)方法對微綠球藻生物量、油脂含量和油脂產量的影響

由圖4可知，在1 940～2 060 lx光照強度下，采用MAV(+N)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d后，微綠球藻的生物量(0.67 g/L)比兩步培養(yǎng)法的生物量(0.50 g/L)高。但在高氮培養(yǎng)下的微綠球藻的油脂含量(16.92%)和油脂產量(0.11 g/L)顯著低于兩步培養(yǎng)法的油脂含量(30.50%)和油脂產量(0.15 g/L)。在缺氮培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素的不均衡，導致微藻的生長繁殖活動受到影響，最終導致微綠球藻的生物量下降。但兩步培養(yǎng)法有利于微藻油脂的合成，其油脂含量為30.50%，約是MAV(+N)培養(yǎng)基培養(yǎng)下的油脂含量的1.8倍。其他研究[13-14]也得出類似的結果，這說明兩步培養(yǎng)法有利于微藻保持較高的生物量、油脂含量和油脂產量。

但值得注意的是兩步缺氮培養(yǎng)法培養(yǎng)的微綠球藻的生物量、油脂含量和油脂產量都顯著降低，分別為0.11 g/L、22.31%和0.03 g/L。同時，兩步缺氮培養(yǎng)法的藻粉呈淺黃色。結果表明，長期處于缺氮條件的微綠球藻細胞已經極大地影響機體的正常代謝活動。這與本實驗室利用柵藻為藻種所報道的結果不一致[9]，主要原因可能是兩者缺氮的控制方法不同。在柵藻兩步缺氮培養(yǎng)法中，將培養(yǎng)至對數(shù)期的柵藻以20%接種量接種于完全缺氮培養(yǎng)基中，此時培養(yǎng)基中的硝酸鉀質量濃度為0.30 g/L，而將對數(shù)期的柵藻培養(yǎng)至穩(wěn)定期所需要的硝酸鉀質量濃度也為0.30 g/L，因此在第一步缺氮培養(yǎng)過程中，先消耗培養(yǎng)基中剩余的氮源，從而將對數(shù)期的柵藻培養(yǎng)至穩(wěn)定期以增加其生物量，這為第二步完全的缺氮培養(yǎng)提供了生物量的保證[9]。而本實驗中，將培養(yǎng)至對數(shù)期的微綠球藻以20%的接種量接種于培養(yǎng)基中，此時并沒有刻意去控制培養(yǎng)基中的硝酸鉀質量濃度正好滿足藻生長需求，有可能此時培養(yǎng)基中的硝酸鉀質量濃度不足以提供將微綠球藻培養(yǎng)至穩(wěn)定期，從而不利于第二步缺氮培養(yǎng)中生物量和油脂的積累。

3 結 論

在硝酸鉀質量濃度為100 mg/L、光照強度為1 940～2 060 lx時，培養(yǎng)12 d，微綠球藻的生物量和油脂含量都最高，分別為0.68 g/L和16.28%。硝酸鉀質量濃度顯著影響微綠球藻的生長和油脂積累。低光照強度(1 940～2 060 lx)下，在不添加硝酸鉀時，微綠球藻的生物量最低(0.39 g/L)，但油脂含量最高(22.62%)；隨著硝酸鉀質量濃度的增加，微綠球藻的生物量逐漸增加，最高可達0.66 g/L；而微綠球藻細胞的油脂含量呈下降趨勢。在缺氮條件下，光照強度會影響微綠球藻的生長和油脂合成。通過兩步培養(yǎng)法，可以促進微綠球藻的油脂合成，油脂含量比高氮培養(yǎng)提高了0.8倍，油脂產量提高了36.36%。因此，為克服微綠球藻培養(yǎng)過程中生物量與油脂含量的矛盾關系，可通過兩步培養(yǎng)法實現(xiàn)微綠球藻的生物量和油脂含量最大化。

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ImprovementofbiomassandoilcontentofNannochlorisoculata

GUO Xiaoye1, QIU Changyang1, HE Yongjin1, CHEN Han1,WANG Mingzi1,2, CHEN Bilian1,2
(1.College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China; 2.Engineering Research Center of Industrial Microbiology of Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China)

The effects of light intensity and mass concentration of potassium nitrate on the biomass and oil content ofNannochlorisoculatawere investigated, and the microalgae was cultivated by two-stage cultivation method to enhance the biomass and oil content. The results showed thatNannochlorisoculataachieved the highest biomass of 0.68 g/L and oil content of 16.28% in the light intensity of 1 940-2 060 lx and mass concentration of potassium nitrate 100 mg/L for 12 d of cultivation. The lowest biomass and highest oil content ofNannochlorisoculatain the nitrogen-deficient medium were 0.39 g/L and 22.62%, respectively at low light intensity (1 940-2 060 lx). An increase in the mass concentration of potassium nitrate resulted in an increase in the biomass and a decrease in the oil content ofNannochlorisoculata. Two-step cultivation method promoted the oil synthesis ofNannochlorisoculata, and the oil content and oil yield were 30.50% and 0.15 g/L, respectively.

Nannochlorisoculata; two-step cultivation; oil; biomass

2017-02-19；

2017-08-09

福建省科技廳農業(yè)引導性項目(2015N0007)；福州市科技局市?？萍己献黜椖?2016-G-73)；福建省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目

郭曉燁(1994)，女，在讀本科，專業(yè)為生物工程(E-mail)gxy015@163.com。

陳必鏈，教授(E-mail)chenbil@fjnu.edu.cn。

生物工程

TQ645;S968.4

A

1003-7969(2017)10-0121-05