陳麗艷 夏 延 王 萍 張 蕾 孫銀玲 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 1 5 0 0 3 6）

·方藥研究·

細(xì)菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝研究*

陳麗艷 夏 延 王 萍 張 蕾 孫銀玲 王偉明**

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 1 5 0 0 3 6）

目的：研究細(xì)菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝。方法：分別以黃豆和黑豆為底物，以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，以4種異黃酮成分的含量為指標(biāo)考察淡豆豉前酵和后酵工藝。結(jié)果：以黃豆和黑豆為底物前酵過(guò)程都出現(xiàn)大豆苷和染料木苷的含量下降，大豆苷元和染料木素含量上升的結(jié)果，后酵樣品中除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，其他異黃酮成分的含量均有不同程度的下降；發(fā)酵后黃豆組結(jié)合型糖苷含量低于黑豆組，苷元含量則高于黑豆組。結(jié)論：從結(jié)合型糖苷的降解和苷元的轉(zhuǎn)化角度分析，生產(chǎn)細(xì)菌型淡豆豉不需要后酵過(guò)程，以黃豆為底物優(yōu)于黑豆。

淡豆豉 底物 后酵 異黃酮 含量

淡豆豉是以大豆為主料，青蒿、桑葉為輔料經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備的傳統(tǒng)中藥，具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱之功效[1]。淡豆豉傳統(tǒng)炮制工藝以黑豆為底物居多[2]，而中國(guó)藥典（2015年版）規(guī)定是成熟大豆的發(fā)酵加工品[3]，未明確黑豆還是黃豆，淡豆豉飲片生產(chǎn)企業(yè)使用的原料也參差不齊。中國(guó)藥典中淡豆豉的制備工藝用“黃衣上遍”和“再悶15～20天”來(lái)控制發(fā)酵過(guò)程，并沒(méi)有考察活性成分或指標(biāo)性成分的變化，再悶的過(guò)程屬于后酵過(guò)程，其對(duì)微生物的生長(zhǎng)、代謝以及發(fā)酵制品的品質(zhì)影響很大，也會(huì)影響初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物的成分和含量[4]，從而直接影響藥效。另外，藥典標(biāo)準(zhǔn)中淡豆豉的生產(chǎn)采用的是多菌種混合自然發(fā)酵，存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、安全性不可靠等問(wèn)題[5]，因此無(wú)菌條件下純菌發(fā)酵淡豆豉成為必然趨勢(shì)。目前對(duì)于淡豆豉發(fā)酵菌種的研究多以細(xì)菌和霉菌居多，每類菌生長(zhǎng)周期及酶系不同會(huì)直接影響淡豆豉的制備工藝和質(zhì)量。關(guān)于細(xì)菌型豆豉的研究已有很多報(bào)道，采用的菌種為公認(rèn)的枯草芽孢桿菌，都是以大豆為底物直接接種細(xì)菌菌液制成[6-8]，而淡豆豉不同于豆豉，是在發(fā)酵過(guò)程中添加了青蒿、桑葉作為共同的藥性基質(zhì)，可促進(jìn)大豆異黃酮苷向苷元的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)了淡豆豉除煩解表功效[9]。

本研究以從市售淡豆豉飲片中分離并經(jīng)酶活篩選的枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，以黃豆和黑豆為發(fā)酵底物，考察前酵和后酵過(guò)程對(duì)淡豆豉中4種異黃酮類成分含量的影響，為淡豆豉炮制工藝的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

DL-CJ-2N型超凈工作臺(tái)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋；KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗器；Sartorius BSA224S電子天平，DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，DK-S24水浴鍋，LG10-2.4A離心機(jī)，Waters e2695-2489高效液相色譜儀。

1.2 材料

桑葉、青蒿購(gòu)自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員分別鑒定為桑Morus alba L.的干燥葉和黃花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分；黑豆購(gòu)自哈爾濱北京同仁堂藥店，鑒定為豆科植物大豆Glycine max (L.) Merr.的干燥成熟種子；黃豆購(gòu)自哈爾濱北京華聯(lián)超市。

大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為D-013-150928、D-016-150423、R-002-150802、R-001-150421。

菌種：分離自淡豆豉飲片（黑龍江德順長(zhǎng)中藥飲片有限公司，批號(hào)：140701），經(jīng)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心鑒定為枯草芽孢桿菌亞種（拉丁名Bacillus subtilis subsp.subtilis）。

2 方法

2.1 淡豆豉樣品的制備

2.1.1 接種液的制備 取保存的枯草芽孢桿菌菌種采用劃線法接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管斜面上，于37℃培養(yǎng)18～24h，加10mL無(wú)菌生理鹽水將斜面菌落沖洗混勻制成菌懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌液濃度為109CFU/mL，備用。

2.1.2 發(fā)酵工藝 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部淡豆豉的制備工藝，分別稱取黃豆、黑豆各100g（平行3份）,洗凈，每份加青蒿、桑葉煎煮液(稱取青蒿7g，桑葉10g，加水煎煮2次，每次0.5h，合并濾液，濃縮至120mL)浸泡，中間翻混兩次，俟煎煮液充分吸盡，裝袋，121℃滅菌40min，放涼，其中黃豆和黑豆組各取2袋，每袋接種2.1.1制備的菌液1mL，搖勻，37℃培養(yǎng)7d（前酵），每種底物樣品各取出一份，另一份平行樣品轉(zhuǎn)置42℃培養(yǎng)15d（后酵），剩余1袋黃豆和1袋黑豆不接種菌液作為空白樣品。

2.2 4種異黃酮成分的含量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量。

2.2.1 色譜條件[10，11]色譜柱：Waters Symmetry C18 （5 μm, 4.6×150 mm）,甲醇為流動(dòng)相A，0.5%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，洗脫程序見(jiàn)表2。流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：40℃，進(jìn)樣量 10 μL。

表 1 洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取對(duì)照品大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素，加甲醇制成含大豆苷11.76 μg/mL，染料木苷15.40 μg/mL，大豆苷元16.80 μg/mL，染料木素12.10 μg/mL的混合對(duì)照品貯備溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 將2.1.2得到的樣品于60℃烘干，粉碎過(guò)80目篩，精密稱取干粉2g置25 mL容量瓶中，加石油醚超聲脫脂，再用80%甲醇溶液超聲30 min，放冷，定容至刻度，混勻，以5000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.45μm濾膜用于高效液相色譜分析。

2.2.4 線性關(guān)系考察 將混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL，按2.2.1的色譜條件測(cè)定，分別以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積(因峰面積較大，故縮小106倍)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程見(jiàn)表2。

表 2 4種異黃酮對(duì)照品線性回歸方程

結(jié)果表明，大豆苷含量在0.024μg～0.164μg，染料木苷含量在0.031μg～0.216μg，大豆苷元含量在0.034μg～0.235μg，染料木素含量在0.024μg～0.169μg內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系。

3 結(jié)果

大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量測(cè)定結(jié)果如表3。與空白組相比，黃豆前酵組大豆苷和染料木苷含量降低了3-5倍，大豆苷元和染料木素的含量分別提高了3倍和1.3倍；黑豆前酵組大豆苷和染料木苷含量均降低了約1.5倍，大豆苷元的含量提高了7.6倍，染料木素含量則有所下降。與前酵相比，后酵樣品中除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，其它樣品及成分的含量均均有不同程度的下降，其中大豆苷分別下降了13.50%和7.20%，染料木苷分別下降39.46%和30.62%，染料木素分別下降94.89%和71.67%。發(fā)酵樣品組中黃豆組結(jié)合型糖苷含量均低于對(duì)應(yīng)的黑豆組，且苷元含量均高于對(duì)應(yīng)黑豆組。

表3 不同樣品4種異黃酮含量測(cè)定結(jié)果(單位：μg/g)

4 討論

通過(guò)淡豆豉發(fā)酵前后異黃酮苷及苷元類成分的含量對(duì)比，前酵樣品苷類向苷元類成分的轉(zhuǎn)化率較高，這與β-葡萄糖苷酶活性升高密切相關(guān)。后酵過(guò)程苷類成分含量進(jìn)一步降低，但不顯著，大豆苷元的含量有一定提高，而染料木素含量下降明顯，表明大豆苷元在酶的作用下相對(duì)比較穩(wěn)定，而染料木素含量的降低可能是后酵15 d在β-葡萄糖苷酶作用下繼續(xù)降解為鷹嘴豆芽素或其他異黃酮苷元類物質(zhì)[12]。與前酵相比，除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，后酵樣品其他異黃酮類成分的含量均有不同程度的下降，發(fā)酵后黃豆組結(jié)合型糖苷含量低于黑豆組，苷元含量則高于黑豆組。由于苷類物質(zhì)不能被人體直接吸收，需轉(zhuǎn)化為苷元才能被利用，因此，從結(jié)合型糖苷的降解和苷元的轉(zhuǎn)化角度分析，生產(chǎn)細(xì)菌型淡豆豉不需要后酵過(guò)程，以黃豆為底物優(yōu)于黑豆。

[1] 李剛,龍凱,蘇明聲,等.淡豆豉炮制至“黃衣上遍”過(guò)程中微生物菌群動(dòng)態(tài)變化的初步研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,24(11):139-142.

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國(guó)家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（2 0 1 5 0 7 0 0 4-0 3）；哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（2 0 1 6 R A X Y J 1 0 1）

** 通信作者