苑鶴毅，王麗敏，劉君，林大勇，劉鴻，白劍,4，張麗艷

(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 沈陽110847；2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3 遼寧省中醫(yī)藥研究院臨床藥理室；4中國(guó)人民解放軍第三〇九醫(yī)院器官移植研究所)

冬凌草甲素對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251殺傷、增殖及NF-κB蛋白表達(dá)的影響

苑鶴毅1，王麗敏2，劉君3，林大勇1，劉鴻1，白劍1,4，張麗艷1

(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 沈陽110847；2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3 遼寧省中醫(yī)藥研究院臨床藥理室；4中國(guó)人民解放軍第三〇九醫(yī)院器官移植研究所)

目的觀察冬凌草甲素對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251殺傷、增殖及NF-κB蛋白表達(dá)的影響。方法將濃度為10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素與U251細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)分別孵育，同時(shí)設(shè)不加冬凌草甲素培養(yǎng)的U251細(xì)胞作對(duì)照組，分別于不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)U251、計(jì)算冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞的IC50、測(cè)算U251細(xì)胞增殖抑制率、檢測(cè)U251細(xì)胞中的NF-κB蛋白。結(jié)果與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組加入40 、80 μmol /L的冬凌草甲素后U251細(xì)胞數(shù)明顯減少(P均lt;0.05)。冬凌草甲素作用24、48 、72 h時(shí)對(duì)U251細(xì)胞的IC50分別為82.2、65.3、44.1 μmol /L。與20 μmol /L冬凌草甲素相比，40、80 μmol /L冬凌草甲素作用48、72 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率明顯降低(P均lt;0.05)。與對(duì)照組相比，40、80 μmol /L的冬凌草甲素作用48、 72 h時(shí)，U251細(xì)胞中NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P均lt;0.05)。結(jié)論冬凌草甲素在體外可殺傷人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，抑制其增殖，下調(diào)其NF-κB蛋白的表達(dá)；冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞的殺傷、增殖抑制作用可與其對(duì)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

冬凌草甲素；腦膠質(zhì)瘤；細(xì)胞生長(zhǎng)；細(xì)胞增殖；NF-κB信號(hào)通路；NF-κB蛋白

人腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的侵襲性腫瘤之一，呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)，與周圍腦組織界限不清，惡性度高，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，患者發(fā)病后存活期短、病死率高，平均存活時(shí)間1.5 a[1，2]。在對(duì)切除的人腦膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行病理檢查過程中發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路的異?；罨谀X膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[3，4]。冬凌草甲素為唇形科香茶菜屬植物冬凌草干燥品的提取物，其主要成分為以貝殼杉烯為骨架的四環(huán)二萜類化合物[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素在體內(nèi)和體外對(duì)人源性和動(dòng)物源性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有明顯抑制作用，其作用機(jī)制與抑制NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。2016年10月1日～2017年4月30日，我們觀察了不同濃度的冬凌草甲素對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251殺傷、增殖及NF-κB蛋白表達(dá)的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、細(xì)胞及試劑 冬凌草甲素純品購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司。人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司。RPMI1640培養(yǎng)液購自美國(guó)Gene公司；Hyclone小牛血清購自美國(guó)Thermo scientific公司； NF-κB(p-P65)和α-Tublin抗體購自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；二抗購自中杉金橋公司；MTT、臺(tái)盼藍(lán)和1.25%胰酶購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其余分析純?cè)噭┵徸試?guó)藥集團(tuán)遼寧分公司。

1.2 冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞的殺傷情況觀察及IC50計(jì)算 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞消化后接種于96 孔板，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每孔細(xì)胞數(shù)為1 ×104個(gè)，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別在每孔加入含10、20、40 、80 μmol /L冬凌草甲素的無血清培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入不含冬凌草甲素的無血清培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)并在第24、48、72 h時(shí)分別用1.25%的胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色并對(duì)每孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以5個(gè)復(fù)孔細(xì)胞數(shù)的平均值繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算24、48 、72 h 時(shí)冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞的IC50。

1.3 冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響觀察 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞消化后接種于96 孔板，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每孔細(xì)胞數(shù)為1 ×104個(gè)，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別于每孔加入含10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素的無血清培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入不含冬凌草甲素的無血清培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。在MTT實(shí)驗(yàn)前用PBS清洗2次，加入5 mg /mL的MTT 20 μL并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，并置搖床15 min。調(diào)整酶標(biāo)儀波長(zhǎng)至 490 nm處，測(cè)算光密度值(OD值)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率= [(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值) /對(duì)照組OD值]×100%。

1.4 冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響觀察 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞消化后接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)組分別加入10、20、40、80 μmol/L的冬凌草甲素，對(duì)照組不加冬凌草甲素，分別于培養(yǎng)48、72 h時(shí)收集部分細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解后收集到1.5 mL的 EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min離心1 min，棄上清備檢。BCA法進(jìn)行NF-κB蛋白定量檢測(cè)：向SDS-PAGE凝膠中加入樣本，電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入NF-κB(1∶1 000)和α-Tublin(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜后，加入二抗37 ℃孵育30 min。采用凝膠成像分析系統(tǒng)，通過各條帶的灰度值計(jì)算NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2. 1 冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞的殺傷情況及IC50各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組U251細(xì)胞計(jì)數(shù)比較見表1。由表1可見，實(shí)驗(yàn)組加入10、20μmol /L的冬凌草甲素后U251細(xì)胞數(shù)無明顯變化，加入40 、80 μmol /L的冬凌草甲素后U251細(xì)胞數(shù)明顯減少。冬凌草甲素作用24、48 、72 h時(shí)對(duì)U251細(xì)胞的IC50分別為82.2、65.3、44.1 μmol /L。

表1 各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組U251細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)

注：與對(duì)照組相比，*Plt;0.05。

2.2 冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響 加入不同濃度冬凌草甲素的實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)U251細(xì)胞增殖抑制率見表2。由表2可見，10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞的增殖在不同的時(shí)間點(diǎn)上均有抑制作用；與20 μmol /L冬凌草甲素相比，40、80 μmol /L冬凌草甲素作用48、72 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率明顯降低(P均lt;0.05)。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，20、40、80 μmol /L冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制率依次降低(P均lt;0.05)。

表2 加入不同濃度冬凌草甲素的實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)U251細(xì)胞增殖抑制率

2.3 冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響 培養(yǎng)48 、72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組U251細(xì)胞中的NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表3。由表3可見，與對(duì)照組相比，不同濃度的冬凌草甲素作用U251細(xì)胞48 、72 h時(shí)，U251細(xì)胞中NF-κB蛋白的表達(dá)均下調(diào)；與對(duì)照組相比，40、80 μmol /L的冬凌草甲素作用48、 72 h時(shí)，U251細(xì)胞中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P均lt;0.05)。

表3 培養(yǎng)48 、72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組U251細(xì)胞中的NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*Plt;0.05。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見也是致死率最高的惡性腫瘤，發(fā)病率約為十萬分之五，患者5年生存率較低，僅為20%左右[1,7]。近年來的研究[7]證實(shí)，NF-κB信號(hào)通路在腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。有研究[1,8]發(fā)現(xiàn)，在活化的星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中和高級(jí)別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，而在低級(jí)別的星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)明顯減弱，在正常腦組中NF-κB表達(dá)很弱甚至無法檢出。如果能夠有效抑制NF-κB通路就可以降低腫瘤的增殖速度，為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供一條新的途徑。

天然抗腫瘤藥物是近年來中藥藥理研究的熱點(diǎn)之一。有研究[9～12]發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能夠抑制不同組織來源的人源性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中包括肺癌細(xì)胞株A149、肝癌細(xì)胞株HepG-2、胃癌細(xì)胞株MKN45和膀胱癌細(xì)胞株MB49等，而且其不良反應(yīng)低，對(duì)肝、腎、骨髓等多種器官均無明顯損傷。冬凌草甲素能夠通過多種途徑發(fā)揮對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻止腫瘤細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白蛋D1的合成及抑制端粒酶活性等途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。目前認(rèn)為冬凌草甲素發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制與調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路、Caspase調(diào)控的凋亡信號(hào)通路及活化ATR通路和NF-κB通路有關(guān)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)濃度為40 μmol /L和80 μmol /L的冬凌草甲素在離體情況下對(duì)U251細(xì)胞作用48 h可對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)揮明顯的抑制作用，并且這種抑制作用呈現(xiàn)一定的時(shí)間和劑量依賴性，作用72 h時(shí)對(duì)U251的抑制率可達(dá)50%以上。在經(jīng)過濃度為40 μmol /L和80 μmol /L的冬凌草甲素孵育48 h后，U251細(xì)胞中NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，孵育72 h后U251細(xì)胞中NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降低。這一研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素在體外可殺傷人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，抑制其增殖，下調(diào)其NF-κB蛋白的表達(dá)。推測(cè)凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞的殺傷、增殖抑制作用可能與其對(duì)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用有關(guān)，也進(jìn)一步提示NF-κB蛋白對(duì)于調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)揮重要作用，如果能夠有效抑制NF-κB蛋白的表達(dá)就能抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤作為一種惡性的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤一直是臨床治療的難點(diǎn)之一，冬凌草甲素有望作為NF-κB通路的抑制劑實(shí)現(xiàn)抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的目的，由于其不良反應(yīng)小，對(duì)肝、腎、骨髓等多種器官均無明顯損傷，具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1] 白劍, 張麗萍, 劉鴻,等. 腦膠質(zhì)瘤組織MIB2蛋白表達(dá)臨床意義分析[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2015,22(23):1809-1812.

[2]王新軍,周少龍,付旭東,等.人腦膠質(zhì)瘤組織HMGB1表達(dá)臨床意義初步分析[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(17):1339-1342.

[3]張忠民,顧志成,王彩霞,等. NF-κB與腦膠質(zhì)瘤的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2015,19(2):330-333.

[4]張微峰,胡容. NF-κB在炎癥相關(guān)癌癥中的雙重作用[J].藥物生物技術(shù),2015,22(1):74-77.

[5] 劉偉峰, 王新帥, 孫君軍,等. 冬凌草甲素通過調(diào)控miRNA-125a誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的研究[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2015, 31(6):459-462.

[6] 張李迪, 高豐厚, 姜斌. 冬凌草甲素對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤抗腫瘤的作用研究[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2016, 45(8):28-32.

[7] 王紅光,賈強(qiáng),張述升,等.波形蛋白、NF-κB促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲性的表達(dá)相關(guān)性及意義[J]. 中國(guó)微侵襲神經(jīng)外科雜志, 2015(6):276-278.

[8] Negi G, Sharma SS. Inhibition of IκB kinase (IKK) protects against peripheral nerve dysfunction of experimental diabetes[J]. Mol Neurobio, 2015, 51(2):591-598.

[9] 郭文治,王冬雨,李功權(quán),等.冬凌草甲素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2015,32(9):2157-2159.

[10] 許文婷,高巧慧,伏艷艷,等.冬凌草甲素逆轉(zhuǎn)SGC7901/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性及其機(jī)制[J].華西藥學(xué)雜志,2016,31(3):262-264.

[11] 王遠(yuǎn)政,田曉濱,劉洋,等.冬凌草甲素通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制人骨肉瘤細(xì)胞143B生長(zhǎng)的機(jī)制研究[J].中國(guó)矯形外科雜志,2016,24(23):2181-2187.

[12] 王文蘭,付彩文,付文浩,等.冬凌草甲素對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制[J].實(shí)用藥物與臨床,2015,18(7):765-768.

[13] 馮耀榮,陳紅淑.冬凌草甲素抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2016,23(1):125-126.

[14] 朱楠.冬凌草甲素抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,33(13):1785-1786.

Effectsoforidoninonkilling,proliferation,andexpressionofNF-κBproteinofhumangliomaU251cellline

YUANHeyi1,WANGLimin,LIUJun,LINDayong,LIUHong,BAIJian,ZHANGLiyan

(1LaboratoryAnimalCenter,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Liaoning110847,China)

ObjectiveTo observe effects of oridonin on killing, proliferation, and expression of NF-κB protein of human glioma U251 cell line.MethodsU251 cells were incubated with oridonin at the concentrations of 10, 20, 40, and 80 μmol/L respectively. At the same time, U251 cells incubated without oridonin were taken as the control group. U251 counting, IC50, U251 cell proliferation inhibition rate and expression of NF-κB were detected at different time points.ResultsCompared with the control group, the number of U251 cells in the 40 and 80 μmol/L oridonin groups decreased significantly (Plt;0.05). After incubation for 24, 48 and 72 h, the IC50of U251 cells was 82.2, 65.3 and 44.1 μmol/L, respectively. Compared with 20 μmol/L oridonin group, the cell proliferation inhibition rates of the 40 and 80 μmol/L oridonin groups were significantly reduced at 48 and 72 h (Plt;0.05). Compared with the control group, the expression of NF-κB in U251 cells decreased significantly (Plt;0.05) in the 40 and 80 μmol/L oridonin group at 48 and 72 h.ConclusionsOridonin can kill U251 cells, inhibit its proliferation and down-regulate NF-κB protein in vitro. The killing effect and inhibition can be related to the regulation of NF-κB signaling pathway.

oridonin; glioma; cell growth; cell proliferation; NF-κB signaling pathway; NF-κB protein

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.005

R329.2

A

1002-266X(2017)43-0014-03

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(201602506)。

苑鶴毅(1986-)，女，學(xué)士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)榭鼓[瘤藥物的機(jī)制研究。E-mail： 15342437@qq.com

張麗艷(1975-)，女，博士，副教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤的中藥治療。E-mail： 512367830@qq.com

2017-08-01)