王 楠，宋小駿，蔣 鳳，謝學(xué)建

維拉帕米及艾灸對長春新堿耐藥胃癌細胞株SGC7901逆轉(zhuǎn)增效作用

王 楠，宋小駿，蔣 鳳，謝學(xué)建

目的觀察維拉帕米(VPM)及艾灸對小鼠長春新堿(VCR)耐藥SGC7901胃癌移植后的瘤體重量、抑瘤率及P-糖蛋白(P-gp)表達的影響，以了解兩者對長春新堿耐藥逆轉(zhuǎn)增效作用。方法分別進行不同劑量維拉帕米及艾灸聯(lián)合不同劑量維拉帕米抗腫瘤耐藥的實驗。第一組實驗將SD小鼠分成等滲鹽水組、VCR對照組、VPM對照組、0.5 mg/kg VPM+VCR組、1.0 mg/kg VPM+VCR組、1.5 mg/kg VPM+VCR組、2.0 mg/kg VPM+VCR組，，每組16只，雌雄各半，所有模型組小鼠在左前肢腋下接種瘤組織，按組給予等滲鹽水和不同劑量藥物，15 d后，取出瘤體稱重，計算抑瘤率，同時留取瘤體標本，檢測多藥耐藥(MDR)相關(guān)蛋白P-gp的變化。第二組實驗將SD小鼠分成等滲鹽水組、VCR對照組、VPM對照組、艾灸對照組、0.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸組、1.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸組、1.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸組、2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸組，每組16只，雌雄各半，所有模型組小鼠在左前肢腋下接種瘤組織，按組給予等滲鹽水和不同劑量藥物及艾灸，15 d后，取出瘤體稱重，計算抑瘤率，同時留取瘤體標本，檢測MDR相關(guān)蛋白P-gp的變化。結(jié)果第一組實驗中給予維拉帕米時，等滲鹽水組與不同劑量藥物組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，隨劑量增加瘤體重量下降、抑瘤率增加和蛋白P-gp表達下降，但1.5 mg/kg和2.0 mg/kg時，蛋白P-gp值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第二組實驗中給予維拉帕米和艾灸時，等滲鹽水組與不同劑量藥物組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，隨劑量增加瘤體重量下降、抑瘤率增加和蛋白P-gp表達下降，其中劑量組:1.5 mg/kg和2.0 mg/kg與僅給予維拉帕米組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論維拉帕米和艾灸對小鼠長春新堿耐藥SGC7901胃癌耐藥具有逆轉(zhuǎn)增效作用，在2.0 mg/kg維拉帕米、0.5 mg/kg長春新堿、艾灸聯(lián)合用藥時可達到單用1.0 mg/kg長春新堿用藥效果。

維拉帕米；艾灸；SGC7901胃癌；長春新堿；耐藥；逆轉(zhuǎn)增效

近年來針對惡性腫瘤的新化療藥物不斷出現(xiàn)，化療方案不斷改進，但普遍存在腫瘤多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)，一直是治療失敗的主要原因，也是化療治療腫瘤以來一直懸而未決的重要問題。因此，克服腫瘤細胞多藥耐藥及增強化療藥物的效果，將關(guān)系到惡性腫瘤患者化療的療效及預(yù)后。

維拉帕米(verapamil，VPM)為鈣通道阻滯劑(鈣拮抗劑)，對腫瘤細胞MDR表型的具有逆轉(zhuǎn)作用[1]。 Bellamy等[2]進一步作了有關(guān)的實驗，單用維拉帕米即能逆轉(zhuǎn)耐藥細胞對阿霉素的拮抗作用,能增加細胞內(nèi)阿霉素的積聚，細胞內(nèi)藥物濃度的增加是通過細胞對藥物外排的減少而實現(xiàn)的?；A(chǔ)研究表明維拉帕米不僅可以與化療藥物競爭細胞膜上 P-170的結(jié)合位點，而且可在 MDR1 基因的轉(zhuǎn)錄水平上抑制 P-170 的表達，增加腫瘤細胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性[3-5]。

艾灸在臨床報道中能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，并能對抗腫瘤藥物起到增效減毒作用，在動物實驗中也取得了進展，為臨床上提供了治療惡性腫瘤患者的一種重要的輔助治療方法，但艾灸療法在惡性腫瘤治療中的應(yīng)用尚處于初期階段，無論是在臨床研究還是實驗研究過程中仍然存在一定的問題，尤其在臨床研究中還需進一步規(guī)范試驗設(shè)計，運用循證醫(yī)學(xué)理論合理評價艾灸治療惡性腫瘤的療效[6-8]；在動物實驗研究中還需進一步深入探討治療腫瘤的作用機制，發(fā)揮艾灸療法在惡性腫瘤治療中的治療作用[9-11]。

本研究以長春新堿(vincristin，VCR)誘導(dǎo)的SGC7901耐藥細胞為研究對象,研究維拉帕米及艾灸對該耐藥細胞移植后瘤體重量、抑瘤率及P-糖蛋白(P-gp)表達的影響，為維拉帕米及艾灸的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 小牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料研究所; 青霉素、鏈霉素為國產(chǎn)哈爾濱制藥總廠; 四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自北方同正生物制品公司; 長春新堿及維拉帕米均為國產(chǎn)，長春新堿為廣東嶺南制藥有限公司，維拉帕米注射劑為上海禾豐制藥有限公司。鼠抗人P-糖蛋白熒光抗體由晶美生物工程有限公司提供。

1.2儀器和設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱: HF151UV 上海力申科學(xué)儀器有限公司; 超凈工作臺: BHC-1000II A/B3蘇州安泰空氣技術(shù)公司; 倒置顯微鏡:CKX41F奧林巴斯; 酶標儀: BHP9504 北京濱松光子技術(shù)有限公司;流式細胞儀:美天旎MACSQuant。

1.3 方法

1.3.1耐藥細胞株 胃癌細胞株SGC-7901/VCR購自上海復(fù)祥生物科技有限公司(采用胃癌SGC-7901細胞株，模擬臨床用藥特點，應(yīng)用高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)的方法，建立胃癌細胞株SGC-7901對長春新堿多藥耐藥細胞系 SGC-7901/VCR)。將所購SGC-7901/VCR細胞在培養(yǎng)液中穩(wěn)定傳代 2 周后，取處于指數(shù)生長期的細胞，常規(guī)胰蛋白酶消化制備單細胞懸液備用。

1.3.2動物模型制作 取指數(shù)生長期SGC-7901/VCR細胞，在SD小鼠左前肢腋下皮下注射SGC-7901/VCR細胞2×106/0.2 mL，獲得實體瘤，選取生長良好、呈淡紅色、魚肉狀的瘤組織，置于等滲鹽水中切成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，備用。取SD小鼠在其左前肢腋下接種瘤組織，同時分組給予等滲鹽水和不同劑量藥物及艾灸。等滲鹽水組腹腔注射等滲鹽水0.1 mL，每日1次，連續(xù)15 d。VCR對照組腹腔注射長春新堿1.0 mg/kg，每日1次，連續(xù)15 d (與維拉帕米及艾灸聯(lián)合應(yīng)用時長春新堿的劑量為0.5 mg/kg)。VPM對照組腹腔注射維拉帕米1.0 mg/kg，每日1次，連續(xù)15 d。艾灸組造模開始后，于接種次日開始施治，施灸局部剃毛露出皮膚，使用艾絨制成半米粒大艾炷，放置于穴位相對部位，用線香點燃，連續(xù)施治15 d。中脘穴灸每日1壯，足三里穴則左右穴位每日交替灸各1壯。

1.3.3不同劑量維拉帕米抗腫瘤耐藥性的研究 采用上述小鼠模型，隨機分為等滲鹽水組、VCR對照組、VPM對照組、0.5 mg/kg VPM+VCR組、1.0 mg/kg VPM+VCR組、1.5 mg/kg VPM+VCR組、2.0 mg/kg VPM+VCR組，每組16只，雌雄各半。每天觀察負瘤小鼠的活動狀況、毛色及食欲情況，每周測量體重。每周測量瘤體體積，15 d后頸椎脫臼處死小鼠，取出瘤體稱重，計算抑瘤率，同時留取瘤體標本，置于液氮中，檢測MDR相關(guān)蛋白(P-gp)的變化。

1.3.4艾灸聯(lián)合不同劑量維拉帕米抗腫瘤耐藥的研究 采用上述小鼠模型，隨機分為等滲鹽水組、VCR對照組、VPM對照組、艾灸對照組、0.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸組、1.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸組、1.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸組、2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸組，每組16只，雌雄各半。每天觀察負瘤小鼠的活動狀況、毛色及食欲情況，每周測量體重。每周測量瘤體體積，15 d后頸椎脫臼處死小鼠，取出瘤體稱重，計算抑瘤率，同時留取瘤體標本，置于液氮中，檢測MDR相關(guān)蛋白P-gp的變化。

1.4瘤重及抑瘤率的計算 打開左前肢腋下,剝離腫瘤,稱重,并計算抑瘤率。

抑瘤率=[(等滲鹽水組的平均瘤重-藥物組的平均瘤重)/等滲鹽水組的平均瘤重]×100%

1.5流式細胞儀檢測P-糖蛋白表達 選取剝離后瘤塊,切成小塊，用胰酶消化，PBS洗滌 2 次，加入200 μL PBS重懸細胞，取100 μL細胞懸液加入鼠抗人P-gp-PE (1∶50) 20 μL，陰性對照另取100 μL懸 液 加 入 鼠 抗 人-Ig G2b-PE 20 μL，混勻后靜置于4 ℃，避光30 min，用 PBS 洗滌去未結(jié)合單抗，400 μL PBS 重懸細胞，上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1不同劑量維拉帕米抗腫瘤耐藥性的瘤體重量、抑瘤率及P-gp值 瘤體重量:對照組、藥物組與等滲鹽水組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；VCR對照組與0.5、1.0和1.5 mg/kg VPM+VCR組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，但與2.0 mg/kg VPM+VCR組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；VPM對照組與1.0、1.5和2.0 mg/kg VPM+VCR組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。抑瘤率：隨著VPM的劑量增加，VPM+VCR聯(lián)合治療的抑瘤率接近于VCR對照組的抑瘤率。P-gp值:對照組、藥物組與等滲鹽水組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；0.5 mg/kg VPM+VCR組與1.0 mg/kg VPM+VCR組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。見表1。

2.2艾灸聯(lián)合不同劑量維拉帕米抗腫瘤耐藥的瘤體重量、抑瘤率及P-gp值 瘤體重量：對照組、藥物組與等滲鹽水組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；VCR對照組與0.5、1.0和1.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，但與2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；VPM對照組、艾灸對照組與1.0、1.5和2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。抑瘤率：隨著VPM的劑量增加，VPM+VCR+艾灸聯(lián)合治療的抑瘤率接近于VCR對照組的抑瘤率。P-gp值：對照組、藥物組與等滲鹽水組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；0.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸組與1.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。1.5、2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸組的P-gp值分別與對應(yīng)與未增加艾灸治療的1.5、2.0 mg/kg VPM+VCR組的P-gp值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。見表2。

表1不同劑量維拉帕米和長春新堿治療后的瘤體重量、抑瘤率及P-gp值比較

組別n瘤體重量(g)抑瘤率(%)P?gp值等滲鹽水組161 493±0 048-0 890±0 064 VCR對照組161 079±0 060?27 70 427±0 040? VPM對照組161 365±0 062?8 60 683±0 018? 0 5mg/kgVPM+VCR組161 435±0 080#3 90 215±0 019?#△ 1 0mg/kgVPM+VCR組161 211±0 038?#△18 90 120±0 018?#△▲ 1 5mg/kgVPM+VCR組161 116±0 031?#△25 30 092±0 012?#△ 2 0mg/kgVPM+VCR組161 093±0 032?△26 80 094±0 011?#△ 與等滲鹽水組比較，?Plt;0 05；與VCR對照組比較，#Plt;0 05；與VPM對照組比較，△Plt;0 05；與0 5mg/kgVPM+VCR組比較，▲Plt;0 05

表2不同劑量維拉帕米和長春新堿及艾灸治療后的瘤體重量、抑瘤率及P-gp值比較

組別n瘤體重量(g)抑瘤率(%)P?gp值等滲鹽水組161 483±0 058-0 879±0 057 VCR對照組161 095±0 053?26 20 426±0 032? VPM對照組161 386±0 086?6 50 742±0 016? 艾灸對照組161 364±0 071?8 00 549±0 021? 0 5mg/kgVPM+VCR+艾灸組161 442±0 067#2 80 208±0 017?#△ 1 0mg/kgVPM+VCR+艾灸組161 219±0 049?#△▲17 80 120±0 016?#△◇ 1 5mg/kgVPM+VCR+艾灸組161 111±0 038?#△▲25 10 074±0 012?#△ 2 0mg/kgVPM+VCR+艾灸組161 085±0 035?△▲26 80 078±0 013?#△ 與等滲鹽水組比較，?Plt;0 05；與VCR對照組比較，#Plt;0 05；與VPM對照組比較，△Plt;0 05；與艾灸對照組比較，▲Plt;0 05；與0 5mg/kgVPM+VCR+艾灸組比較，◇Plt;0 05

3 討 論

維拉帕米對人胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR多藥耐藥性具有逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，有研究結(jié)果表明維拉帕米可以使SGC7901/VCR的MDR1基因表達水平和P-gp糖蛋白表達降低，細胞對化療藥物的敏感性明顯增加[12-14]；本文的結(jié)果顯示，維拉帕米與VCR配伍使用時，有增效作用，在2.0 mg/kg劑量時，與半劑量的VCR配伍，基本能達到足劑量VCR的效果，再次證明維拉帕米對于VCR耐藥的SGC7901細胞具有逆轉(zhuǎn)增效作用。

艾灸確有調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)免疫的作用，能改善小鼠生存質(zhì)量，在腫瘤免疫相關(guān)指標如細胞因子的表達等多方面證明艾灸具有免疫調(diào)節(jié)作用[15]。本文中艾灸在與維拉帕米配伍時在維拉帕米達1.5 mg/kg劑量時的降低P-gp糖蛋白表達效果明顯，但在低劑量組時組間相比無顯著性差異，提示艾灸需要與維拉帕米高劑量時配伍能起到好的療效；由于艾灸所具有的調(diào)節(jié)免疫的作用，因此首先表現(xiàn)具有降低P-gp糖蛋白的作用，但瘤體重量、抑瘤率暫無改善；由于本實驗的動物例數(shù)及艾灸的時間所限，可能影響了實驗的結(jié)果，在后期的實驗中將加大動物例數(shù)和增加艾灸的時間進一步考察艾灸對腫瘤生長的影響。

從本文結(jié)果可以看出維拉帕米和艾灸聯(lián)合用藥具有逆轉(zhuǎn)SGC7901細胞VCR耐藥和增效，但還需要進一步考察兩者聯(lián)合效價，擴大實驗樣本量，從而提高實驗數(shù)據(jù)的可信性，以進一步驗證維拉帕米和艾灸在抗腫瘤方面具有高效療效的相關(guān)特性。

[1] Fang G, Yang YL, Li JS,etal.R-dl-verapamil downmodulates multidrug resistance of KBv200 cells to vincristine and doxorubicin[J]. Acta Pharmacol Sin，1999,20(7):647-650.

[2] Bellamy WT，Dalton WS，Kailey JM，etal. Verapamil reversal of doxorubicin resistance in multidrug-resistant human myeloma cells and association with drug accumulation and DNA damage[J].Cancer Res，1988，48(22):6365-6370.

[3] 方 剛,侯亞義,楊玉龍,等. R-型維拉帕米逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥的實驗研究[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2000,13(5):285-288.

[4] 平玉杰,趙麗輝,霍偉英,等.吡柔比星聯(lián)合維拉帕米膀胱灌注對膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)防效果分析[J].中國性科學(xué),2013,22(7):12-14.

[5] 王飛通,汪正偉,劉小云,等.維拉帕米對體內(nèi)外胰腺癌SW1990細胞侵襲轉(zhuǎn)移影響及其機制探討[J].中華腫瘤防治雜志,2015,22(1):39-44.

[6] 徐天舒,王玉娟,李 明,等.麥粒灸后三里穴對環(huán)磷酰胺化療腫瘤小鼠免疫功能的影響[J].江蘇中醫(yī)藥,2013,45(11):72-74.

[7] 張 樂,徐 騰,廖 軍,等.艾灸對肝癌裸鼠移植瘤PCNA、Cyclin D1、CDK4表達影響的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(4):1001-1003.

[8] 郝智慧,徐蘭鳳.艾灸抗腫瘤作用研究概況[J].江蘇中醫(yī)藥,2014,46(1)：79-81.

[9] 何 娟,劉曉磊,彭文興. P-糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)機制研究進展[J]. 中國藥房,2006,17(3):218-220.

[10] 蔡利軍,宋淑萍,呂 賓,等.溫郁金醇提物對人耐長春新堿胃腺癌細胞SGC-7901皮下移植瘤的逆轉(zhuǎn)作用及對P糖蛋白表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014，34(11):1347-1353.

[11] 武 兵,龐家秉,韓 霞,等.榭皮素對耐長春新堿U251/Vin細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用[J].中國臨床研究,2014，27(3):272-276.

[12] 張敏娟,張慶瑜,康春生,等.維拉帕米逆轉(zhuǎn)胃癌細胞系SGC7901/VCR多藥耐藥性的研究[J]. 國際消化病雜志,2008,28(2):166-168.

[13] 邢 璐,崔純瑩,王玉記,等.巰嘌呤/維拉帕米-介孔氧化硅釋藥系統(tǒng)的構(gòu)建及逆轉(zhuǎn)耐藥活性研究[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,36(2):161-165.

[14] 梅 梅,張 翼,任金紅,等.新型紫杉烷化合物 NPB304 及其協(xié)同維拉帕米逆轉(zhuǎn)耐藥的研究[J].藥學(xué)學(xué)報,2014,49(9):1279-1288.

[15] 付 鈴,萬 茜,徐天舒.麥粒灸對Lewis荷瘤小鼠Treg細胞表達的影響[J].針灸臨床雜志,2015,31(1):58-60.

2017-08-14;

2017-10-12)

(本文編輯：葉華珍; 英文編輯：王建東)

ReversalandsynergisticeffectofverapamilandmoxibustiononvincristineresistanceinmicewithSGC7901gastriccancer

WANG Nan，SONG Xiao-jun，JIANG Feng，XIE Xue-jian

(DepartmentofPharmacy，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China)

ObjectiveThe purpose of this study is to investigate the effect of verapamil and moxibustion on the tumor inhibitory rate and the tumor weight and the expression of P- glycoprotein after the transplantation of vincristine (VCR) resistant SGC7901 gastric cancer in mice, so as to understand the reversal effect of these two drugs on vincristine resistance.MethodsIn first group SD mice were divided into normal saline group, vincristine control group, Verapamil control group, No.1 drug group, No.2 drug group, No.3 drug group, No.4 drug group, 16 rats in each group, Half and half on male and female, all mice inoculated with tumor tissue in the left forelimb, and administered with different doses of drugs and moxibustion. On 15 days later, inhibition rate of the tumor was calculated. At the same time for tumor specimens, changes of MDR related protein P-gp are detected. In second group SD mice were divided into normal saline group, vincristine control group, Verapamilcontrol group, Moxibustion group, No.1 drug + Moxibustion group, No.2 drug + Moxibustion group, No.3 drug + Moxibustion group, No.4 + Moxibustion drug group, 16 rats in each group, Half and half on male and female, all mice inoculated with tumor tissue in the left forelimb, and administered with different doses of drugs and moxibustion. On 15 days later, inhibition rate of the tumor was calculated. At the same time for tumor specimens, changes of MDR related protein P-gp are detected.ResultsOnly to give the Verapamil treatment, there was significant difference between the Saline group and different dose groups (Plt;0.05), the tumor inhibition rate increased and the tumor weight and protein P-gp decreased along with the increase of the drug dose; At the 1.5 mg/kg and 2.0 mg/kg, there was no significant difference in protein P-gp. To give Verapamil and Moxibustion treatment, there is also a significant difference in the saline group and different dose groups (Plt;0.05), and the tumor inhibition rate increased and the tumor weight and protein P-gp decreased along with the increase of the dose. At the dose group (1.5 mg/kg and 2.0 mg/kg) there were significant differences between the treatment group compared with group of the given only Verapamil (Plt;0.05).ConclusionVerapamil and Moxibustion on mice of Vincristine (VCR) resistant SGC7901 gastric cancer has reverse effect, and which effect can be equivalent to one of 1.0 mg/kg VCR when Verapamil is 2.0 mg/kg and VCR is 0.5 mg/kg with Moxibustion therapy.

Verapamil；Moxibustion；SGC7901 gastric cancer；Vincristine；Drug resistance；Reversalandsynergism

R9

A

1672-271X(2017)06-0587-05

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.06.007

江蘇省藥學(xué)會-奧賽康醫(yī)院藥學(xué)科研基金項目(201201)

210002 南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥品科

謝學(xué)建，E-mail：njzyxxj2@sina.com

王 楠，宋小駿，蔣 鳳,等.維拉帕米及艾灸對長春新堿耐藥胃癌細胞株SGC7901逆轉(zhuǎn)增效作用[J].東南國防醫(yī)藥，2017,19(6):587-591.