李文靜+洪博++劉軍+張杰+徐天嬌+王玉春

[摘要] 目的 建立同時(shí)測定甘遂半夏湯中尿嘧啶核苷、肌苷、鳥嘌呤核苷、芍藥內(nèi)脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷6種化學(xué)成分含量的方法，為甘遂半夏湯的質(zhì)量控制提供一定理論依據(jù)。 方法 安捷倫（Agilent）TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；柱溫：30℃；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈-水溶液梯度洗脫；進(jìn)樣量：20 μL。 結(jié)果 各對照品在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.9995；加樣回收率為98.1%～101.2%，RSD≤3.3%。 結(jié)論 本法操作簡單、快速、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可為甘遂半夏湯的質(zhì)量控制的制訂奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜；甘遂半夏湯；含量測定；質(zhì)量控制

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（c）-0130-04

Determination the contents of six compounds in Gansuibanxia Decoctions by high performance liquid chromatography

LI Wenjing HONG Bo LIU Jun ZHANG Jie XU Tianjiao WANG Yuchun

School of Pharmacy， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China

[Abstract] Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of six compounds （uridine， carnine， guanosine， albiflorin， liquiritin， liquiritin apioside） in Gansuibanxia Decoctions， in order to provide a theoretical basis for the quality control of Gansuibanxia Decoction. Methods The Agilent TC-C18 column （4.6 mm×250 mm×5 μm） was used at 30℃ with acetonitrile-water （gradient elution） as the mobile phase； the detective wavelength was 254 nm； the flow rate was 1.0 mL/min； the injection volume was 20 μL. Results Every standards showed a good linear relationship in the linear range， the correlation coefficients were all more than 0.9995. The recoveries were in the range of 98.1%-101.2%. RSDs were all less than 3.3%. Conclusion The method established in this paper is simple and fast with good accuracy and repeatability. It may lay the foundation for the quality control of Gansuibanxia Decoctions.

[Key words] HPLC； Gansuibanxia Decoctions； Determination； Quality control

甘遂半夏湯始載于張仲景《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》的方藥，方劑由甘遂、半夏、芍藥、甘草4味中藥組成，主治留飲欲去而不能盡除之癥，由于本方作用峻猛，因此限制了其臨床應(yīng)用的范圍，臨床多用于治療肝癌、肺心病腹水、小兒哮喘等[1-4]。甘遂，有毒，其峻下逐水力峻[5-6]。半夏，有燥濕化痰、降逆止嘔的功效[7-9]。芍藥，具有散瘀止痛、活血化瘀的功效[10-12]。甘草能緩解峻烈藥物的毒性[13-15]。中藥湯劑是一個(gè)復(fù)雜的混合物體系，需要釆用不同的先進(jìn)分析技術(shù)，從不同的角度對中藥的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。甘遂半夏湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在國內(nèi)外的研究較少，多見有臨床應(yīng)用的報(bào)道文獻(xiàn)[16-18]。尿嘧啶核苷、肌苷、鳥嘌呤核苷、芍藥內(nèi)脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷是甘遂半夏湯中重要的活性成分[19-21]。本文首次采用反相高效液相色譜（HPLC）程序洗脫法對甘遂半夏湯中此6種化學(xué)成分含量進(jìn)行同時(shí)測定，可以充實(shí)甘遂半夏湯的藥對理論及實(shí)驗(yàn)研究，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-1000D型液相色譜儀（山東魯南瑞虹化工儀器有限公司）；DG160型中藥粉碎機(jī)（浙江省瑞安市春海藥材器械廠）；JY1002多功能電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；JRT1型調(diào)溫電熱套（遼陽博大科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甲醇、乙腈均為色譜純（美國Fisher試劑公司），水為三重蒸餾水，尿嘧啶核苷（20160324）、肌苷（20161127）、鳥嘌呤核苷（20160116）、芍藥內(nèi)脂苷（20151224）、甘草苷（20151109）、芹糖甘草苷（20160612）均購于中國食品藥品檢定研究院。甘遂、半夏、芍藥和甘草藥材購于齊齊哈爾新特藥有限公司，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室郭麗娜教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 分別精密稱取尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、芹糖甘草苷對照品適量置于100 mL量瓶中，加甲醇適量、溶解并稀釋至刻度，制得濃度分別為160.4、30.80、156.3、28.30、602.5、66.40 μg/mL的對照品貯備液。依次精密量取上述對照品貯備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于5個(gè)10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，制得系列對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取樣品粉末3.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密稱定，加水40 mL，稱定重量，回流提取2 h，放置室溫，再稱定重量，加水補(bǔ)足減失的重量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾制得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：安捷倫（Agilent）TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫：0～15 min 3%乙腈；15～25 min 3%～5%乙腈；25～35 min 5%～10%乙腈；35～40 min 10%～25%乙腈；40～55 min 25%～35%乙腈；55～60 min 35%～25%乙腈；60～65 min 25%～10%乙腈；65～67 min 10%～3%乙腈；67～70 min 3%乙腈；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測波長為254 nm。在上述條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1，待測組分的分離度良好，與其他成分無干擾。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取“2.1.1”項(xiàng)下系列對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各對照品峰面積，以各成分濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得尿嘧啶核苷的回歸方程：Y=3.31×105X-76205（r=0.9988）；肌苷的回歸方程：Y=9.20×105X-15163（r=0.9976）；鳥嘌呤核苷的回歸方程：Y=1.06×105X+60458（r=0.9996）；芍藥內(nèi)脂苷的回歸方程：Y=3.23×105X-12533 （r=0.9994）；甘草苷的回歸方程：Y=9.20×105X-23592.4（r=0.9973）；芹糖甘草苷的回歸方程：Y=1.12×106X+86948.17（r=0.9987）。結(jié)果表明尿嘧啶核苷、肌苷、鳥嘌呤核苷、芍藥內(nèi)脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷分別在1.604～32.080 μg/mL，0.308～6.180 μg/mL，1.563～31.26 μg/mL，0.283～5.660 μg/mL，6.025～120.500 μg/mL，0.664～13.280 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取中濃度點(diǎn)的混合對照品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值。結(jié)果尿嘧啶核苷、肌苷、鳥嘌呤核苷、甘草苷、芍藥內(nèi)脂苷、芹糖甘草苷峰面積的RSD值分別為1.05%、1.56%、1.17%、1.92%、1.67%和1.25%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按上述供試品的制備方法，制備一份樣品，分別于室溫下0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，記錄各待測成分的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值。結(jié)果尿嘧啶核苷峰面積的RSD為1.40%，肌苷峰面積的RSD為1.86%，鳥嘌呤核苷峰面積的RSD為1.53%，芍藥內(nèi)脂苷峰面積的RSD為0.68%，甘草苷峰面積的RSD為1.27%，芹糖甘草苷峰面積的RSD為0.43%，結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按上述供試品的制備方法，平行制備6份樣品，依法測定，記錄峰面積，根據(jù)峰面積和取樣量計(jì)算樣品中成分的含量，以6份含量的RSD來表示重復(fù)性。尿嘧啶核苷含量的RSD為1.02%，肌苷含量的RSD為0.98%，鳥嘌呤核苷含量的RSD為1.15%，芍藥內(nèi)脂苷含量的RSD為1.45%，甘草苷含量的RSD為1.24%，芹糖甘草苷含量的RSD為1.29%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品約1.65 g，分別置于6個(gè)圓底燒瓶中，分別按照已知量的100%加入對照品，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算待測成分的加樣回收率和RSD，結(jié)果見表1。尿嘧啶核苷、肌苷、鳥嘌呤核苷、芍藥內(nèi)脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷6個(gè)成分回收率的RSD分別為1.20%、2.39%、1.80%、2.50%、2.50%、2.50%。

2.4 樣品含量的測定

按上述供試品溶液制備方法平行制備3份供試品溶液，按照上述色譜條件測定，記錄峰面積，由得到的數(shù)據(jù)及各主要成分的回歸曲線計(jì)算含量。見表2。

3 討論

3.1 分析方法的建立

中藥湯劑的化學(xué)成分復(fù)雜，含量微少，一般的分析儀器與方法難以對復(fù)方中藥成分進(jìn)行分離和檢測。本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法首次同時(shí)測定了甘遂半夏湯中6種有效成分的含量，方法簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，便于推廣。并且對不同比例與組成的流動(dòng)相、柱溫、檢測波長、流速等因素予以考察，選擇分離度較高、基線平整的色譜條件。

3.2 色譜條件最終的確定

筆者在前期實(shí)驗(yàn)過程中已經(jīng)盡力摸索，因?yàn)榍?個(gè)色譜峰尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷與后面3個(gè)色譜峰芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷和芹糖甘草苷極性相差較大，進(jìn)行同時(shí)測定的時(shí)候溶劑梯度跨度較大，易引起基線的不穩(wěn)，導(dǎo)致上?。欢?個(gè)色譜峰的極性又很相似，摸索了很多條件，很難達(dá)到基線分離，所以直至最終實(shí)驗(yàn)條件的確定，筆者認(rèn)為本文的色譜條件是用該儀器能同時(shí)測定甘遂半夏湯中6個(gè)待測成分的最佳分離條件。而且本文的積分都是設(shè)定好色譜儀參數(shù)進(jìn)行的自動(dòng)積分，消除了手動(dòng)積分的誤差，同時(shí)通過方法學(xué)考察可以看出本研究建立的方法準(zhǔn)確、可行。

3.3 結(jié)論

本研究建立的HPLC-UV方法能同時(shí)分離測定甘遂半夏湯中的尿嘧啶核苷、肌苷、鳥嘌呤核苷、芍藥內(nèi)脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷6個(gè)成分的含量，方法簡單、可靠、易重復(fù)，測定時(shí)間短且無雜質(zhì)干擾，可用于甘遂半夏湯的質(zhì)量控制研究。

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（收稿日期：2017-08-15 本文編輯：程 銘）