趙 丹，劉 瑩，宋愛環(huán)，劉夢俠，王 慧，劉洪軍

( 1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院， 山東 泰安 271018；2. 山東省海洋生物研究院， 山東 青島 266104；3.青島市海洋生物種質(zhì)資源挖掘與利用工程實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266104 )

基于線粒體COⅠ序列的泥螺群體遺傳多樣性研究

趙 丹1，劉 瑩2,3，宋愛環(huán)2,3，劉夢俠2,3，王 慧1，劉洪軍2,3

( 1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院， 山東 泰安 271018；2. 山東省海洋生物研究院， 山東 青島 266104；3.青島市海洋生物種質(zhì)資源挖掘與利用工程實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266104 )

為初步研究泥螺的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，探討其遺傳多樣性的產(chǎn)生背景和維持機(jī)制，便于今后更好地保護(hù)泥螺種質(zhì)資源，本研究對遼寧、山東、江蘇、浙江四省7個泥螺群體的線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)部分序列進(jìn)行了測定與分析，經(jīng)過處理得到145條631 bp長度的核苷酸片段，分析顯示A、G、T、C、A+T的平均含量分別為23.83%、18.93%、41.60%、15.64%、65.43%，AT 含量高于 GC 含量。單倍型總數(shù)47，共享單倍型數(shù)目12。用Arlequin 3.5 軟件進(jìn)行AMOVA 分析，表明7個群體間 COⅠ總遺傳分化系數(shù)為0.7893(P<0.001), 群體間遺傳分化大于群體內(nèi)遺傳分化。用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，7個地理群體的泥螺互相聚在一起，同一群體之間沒有明顯獨(dú)立聚在一起的情況。分子方差分析表明群體間出現(xiàn)明顯的遺傳分化。

泥螺；線粒體COⅠ基因；遺傳多樣性

泥螺(Bullactaexarata)，屬軟體動物門、腹足綱、后鰓亞綱、頭楯目、阿地螺科，貝殼呈白色,光滑半透明，殼型卵圓形，廣泛分布于我國沿海的潮間帶灘涂[1]，且生長快、適應(yīng)力強(qiáng)[2]、繁殖周期短。泥螺于2001年首次被引入黃河三角洲東營海區(qū)，其后分布范圍迅速擴(kuò)大，并且成為該地區(qū)的優(yōu)勢物種，對當(dāng)?shù)貪O業(yè)資源的發(fā)展也產(chǎn)生一定影響，已經(jīng)成為當(dāng)?shù)厥聦?shí)上的入侵物種。

分子標(biāo)記是檢測物種群體遺傳結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)地理格局的有效方法，可以從基因水平上直接反映遺傳變異狀況，而不受生活環(huán)境、地理因素以及基因表達(dá)的限制[3]。其中線粒體DNA作為一種分子標(biāo)記，具有嚴(yán)格遵守母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，被廣泛用于遺傳學(xué)研究[4]。COⅠ序列較為保守，在近緣物種間構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時能發(fā)揮重要作用，主要用于無脊椎動物的種群遺傳結(jié)構(gòu)以及多樣性研究[5-7]。根據(jù)基因序列包含的信息可以推測泥螺的進(jìn)化過程，探討其遺傳多樣性的產(chǎn)生背景和維持機(jī)制[8]。

目前，我國對于泥螺的研究大部分集中于生長、發(fā)育、繁殖以及其生物入侵風(fēng)險評價等生理生態(tài)方面，對其遺傳多樣性研究較少，杜慧霞等[9]曾進(jìn)行過泥螺微衛(wèi)星開發(fā)的研究。筆者基于線粒體COⅠ序列對我國南北沿海不同地區(qū)的泥螺群體進(jìn)行了遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，以期為泥螺資源的合理利用以及制定漁業(yè)資源保護(hù)措施、防止外來物種基因入侵等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣

于2015年8月，分別從遼寧大連，山東東營、萊州、黃島，江蘇南通，浙江舟山、寧波7個灘涂海域采集泥螺個體，樣品均經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定， 以95%酒精保存。選擇阿地螺科短麗羅螺(Liloacurta)作為外群進(jìn)行遺傳學(xué)分析。

1.2 基因組DNA的提取與PCR擴(kuò)增

取泥螺腹足部肌肉約30 mg，采用TIANGEN海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒獲得基因組DNA，溶于TE緩沖液，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用線粒體DNA無脊椎動物COⅠ序列通用引物：LCO1490(5′-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)，由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，其中包括：DNA模板1 μL，正反向各1 μL，無菌水9.5 μL，MIX溶液12.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃變性30 s，45.8 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。所有的PCR反應(yīng)均在Eppendorf (Master cycler 5333)擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，對于擴(kuò)增效果良好的樣品送往上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行純化后單向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各個泥螺序列利用DNASTAR軟件進(jìn)行比對，并進(jìn)行人工校正。用Mega 5.1 軟件[10]分析群體的轉(zhuǎn)換/顛換值、堿基組成、變異位點(diǎn)、兩兩群體之間的遺傳距離；采用Arlequin 3.5軟件計算單倍型多樣度、核苷酸多樣度和兩兩序列比對平均核苷酸差異數(shù)；進(jìn)行P檢驗(yàn)，并計算群體間的遺傳分化指數(shù)，檢驗(yàn)群體遺傳分化。采用中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對分布分析兩種方法，檢測群體歷史動態(tài)。用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各結(jié)點(diǎn)的支持率以序列數(shù)據(jù)集1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值表示。用NetWork 4.6.1.1 Median joining計算方法構(gòu)建所有單倍型的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 線粒體COⅠ基因片段序列分析以及單倍型分析

對泥螺7個群體共145個個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到長度為631 bp的片段，分析共包含67個多態(tài)性位點(diǎn)，變異百分率為10.62%。檢測到61處轉(zhuǎn)換和8處顛換，轉(zhuǎn)換高于顛換，說明各群體分歧時間短，親緣關(guān)系近。堿基組成顯示A、G、T、C、A+T的平均含量分別為23.83%、18.93%、41.60%、15.64%、65.43%，T>A>G>C，AT含量高于GC含量。

單倍型分布情況見表1，黃島單倍型種類最多，有15種單倍型；其次為大連、東營和南通，單倍型種類最少為舟山和寧波；總共47種單倍型，COⅠ單倍型的GenBank登錄號為:KX304014～KX304060。群體間共享單倍型有12種，35種獨(dú)有單倍型，各群體都有獨(dú)有單倍型。不存在與其他種群沒有共享單倍型的群體，但不存在所有群體共有的單倍型，黃島除了不與大連存在交叉外，與其他群體均有共享型，多數(shù)群體出現(xiàn)的共享單倍型只存在部分種群中。出現(xiàn)頻率最高的單倍型是單倍型13和單倍型28，說明這兩個單倍型為泥螺在長期進(jìn)化中形成的較為穩(wěn)定的優(yōu)勢基因型。

表1 泥螺各群體間單倍型分布情況

2.2 泥螺群體多樣性分析

總體單倍型多樣性為0.913±0.014，核苷酸多樣性0.016±0.008，各群體單倍型多樣性為0.432～0.910,大連單倍型多樣性最高，萊州、南通次之，舟山單倍型多樣性最低；核苷酸多樣性為0.001～0.017，萊州、南通的核苷酸多樣性最高，舟山、寧波核苷酸多樣性最低(表2)。

表2 泥螺遺傳多樣性參數(shù)

2.3 種群之間的遺傳分化

群體間遺傳距離為0.001～0.017，寧波和舟山遺傳距離最小，黃島和舟山、寧波之間遺傳距離最大。泥螺群體遺傳分化指數(shù)范圍為0.000～0.996，參照資料遺傳分化指數(shù)為0～0.05，群體間無遺傳分化；0.05～0.15為中等遺傳分化；0.15～0.25為高度遺傳分化；大于0.25則遺傳分化極顯著[11]。東營和黃島遺傳分化指數(shù)較小，其次為舟山與寧波，均無遺傳分化，東營與寧波、舟山遺傳分化指數(shù)最大，遺傳分化極為顯著(表3)。通過 PAUP 和Modeltest 軟件計算，得到泥螺最佳替換模型為HKY+I+G(G=0.016) ?？傔z傳分化系數(shù)為0.7893，群體間遺傳分化大于群體內(nèi)遺傳分化(表3)。

表3 泥螺群體之間的遺傳分化指數(shù)及其對應(yīng)的P值

注：對角線左下方為遺傳分化指數(shù)值，右上方為遺傳分化指數(shù)對應(yīng)的P值.

2.4 群體歷史動態(tài)分析

經(jīng)Tajima′s D[12-13]和Fu′s FS[14]檢驗(yàn)，總體Tajima′D值為-0.526，F(xiàn)s值為-1.480，P>0.1，偏離中性但不顯著。種群可能受到了基因隨機(jī)漂變的因素影響，中性檢驗(yàn)的值為負(fù)值說明群體在進(jìn)化的過程中可能出現(xiàn)過群體急速擴(kuò)張的事件。對各個地理群體進(jìn)行中性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示黃島、東營為明顯的負(fù)值且統(tǒng)計檢驗(yàn)是極顯著的(表4)。核苷酸不配對分布圖(圖1)上出現(xiàn)明顯的單峰，進(jìn)一步證明泥螺發(fā)生過群體擴(kuò)張。通過公式τ=2ut轉(zhuǎn)化為實(shí)際的擴(kuò)張時間，τ=16.85。參照無脊椎動物核苷酸堿基的突變率值

圖1 泥螺線粒體COⅠ核苷酸不配對分布

2.5 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

構(gòu)建基于 COⅠ基因片段的鄰接系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)，不存在群體內(nèi)個體明顯首先聚在一起的情況，各個群體的個體交叉存在于系統(tǒng)樹中。采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示無顯著的遺傳拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，單倍型在各個群體中的頻率分布也未出現(xiàn)以某種單倍型為主的明顯的地理分支。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)顯示不同群體的單倍型分散相連聚集在一起，未形成譜系結(jié)構(gòu)。分子方差分析表明群體間出現(xiàn)明顯的遺傳分化，推測群體尚未在遷移與漂變間達(dá)到平衡是未檢測到顯著地理譜系結(jié)構(gòu)的主要原因。

表4 群體歷史動態(tài)部分參數(shù)

圖2 以短麗羅螺為外群構(gòu)建的泥螺線粒體COⅠ序列構(gòu)建的單倍型鄰接關(guān)系樹

3 討 論

郭奕惠等[15]通過分析羅非魚(Oreochromis)不同種群包括尼羅羅非魚(O.niloticus)、奧利亞羅非魚(O.aureus)、莫桑比克羅非魚(O.mossambicus)、雜交種尼奧羅非魚(O.niloticus♀×O.aureus♂)、奧尼羅非魚和紅羅非魚(O.niloticus×O.mossambicus)的線粒體COⅠ序列來研究種間親緣關(guān)系，張龍崗等[16]也利用COⅠ基因分析了澳洲蟲紋鱈鱸(Maccullochellapeelii)群體遺傳多樣性,反映了COⅠ基因研究種群關(guān)系的可行性。本文通過比較不同種群以及群體內(nèi)部COⅠ序列的差異，對泥螺的分子系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示大部分地區(qū)的泥螺群體有較高的遺傳多樣性，群體間出現(xiàn)明顯的遺傳分化。總體來看，長江以北群體遺傳多樣性較高，以南的舟山、寧波兩個群體遺傳多樣性非常低，推測兩群體很少與其他地區(qū)的泥螺進(jìn)行雜交。東營與黃島，舟山與寧波之間無遺傳分化，說明兩兩群體之間發(fā)生了頻繁的基因交流或者兩群體是由同一群體通過種群擴(kuò)張發(fā)展而來。但是兩地區(qū)并不存在空間上的連續(xù)性，可知人類活動是造成基因流的主要因素。泥螺的系統(tǒng)進(jìn)化樹、單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示出大的遺傳分化但沒有出現(xiàn)相應(yīng)的地理分支，原因可能是人為干擾從遠(yuǎn)距離引進(jìn)泥螺進(jìn)行培育改變了泥螺分布的空間格局。另一種原因是現(xiàn)有的群體都來源于共同的祖先，生存環(huán)境的相似導(dǎo)致沒有出現(xiàn)顯著的地理分支。歷史動態(tài)分析種群擴(kuò)張時間為中更新世時期，當(dāng)時的氣候環(huán)境、地質(zhì)發(fā)生了劇烈變化，會導(dǎo)致一定程度的遺傳分化。隨著人類活動的影響，各群體之間的基因交流使得遺傳分化變小，因此沒有形成顯著的地理結(jié)構(gòu)。AMOVA分析種群間遺傳分化大于種群內(nèi)部，可能與泥螺自身的遷移能力以及龐大的群體數(shù)目大大降低了種內(nèi)個體間的遺傳差異。黃河三角洲地區(qū)的泥螺具有較高的遺傳多樣性，據(jù)記載該地區(qū)原本不存在泥螺，2001年8月墾利縣從江蘇、遼寧引進(jìn)種苗進(jìn)行泥螺養(yǎng)殖[17-18]，后逐漸傳播至黃河以北地區(qū)。泥螺繁殖力強(qiáng)，產(chǎn)下的卵袋隨潮漲落，使泥螺向四周迅速擴(kuò)散。由于當(dāng)?shù)啬嗦莶皇芡睹绱胧┑目刂?，天敵少，其分布范圍迅速擴(kuò)大，逐漸形成現(xiàn)有的穩(wěn)定群體。所以，除了種群自然分布因素外，養(yǎng)殖是造成各地區(qū)泥螺遺傳多樣性指數(shù)差異的主要原因。

目前，由于泥螺存在交叉引進(jìn)的現(xiàn)象，土著種越來越少，人類干擾導(dǎo)致的非自然的雜交過程對物種的生存、進(jìn)化也會產(chǎn)生負(fù)面影響。一方面，雜交育種有利于提高泥螺的遺傳多樣性，為物種進(jìn)化提供原材料[19]。但另一方面當(dāng)小種群與大種群發(fā)生雜交時，小種群很易受遺傳同化的影響而滅絕[20-21]。當(dāng)本地泥螺競爭能力弱、個體數(shù)目少、生殖壁壘不強(qiáng)時，其他地區(qū)泥螺與本地種的雜交會威脅到本地泥螺基因組的完整性和原始性，可能在很短的幾個世代內(nèi)就能直接或間接地導(dǎo)致當(dāng)?shù)啬嗦轂l危甚至滅絕[22]。因此，為避免近交衰退而導(dǎo)致的遺傳多樣性水平的進(jìn)一步降低，應(yīng)制定科學(xué)的泥螺引種操作規(guī)程，在保證泥螺養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的同時，又要避免泥螺過度繁殖對當(dāng)?shù)貪O業(yè)資源造成的負(fù)面影響。

圖3 單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

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GeneticDiversityofSnailBullactaexarataPopulationsBasedonMitochondrialDNACOⅠ

ZHAO Dan1, LIU Ying2,3, SONG Aihuan2,3, LIU Mengxia2,3, WANG Hui1, LIU Hongjun2,3

( 1. College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai′an 271018, China; 2. Marine Biology Institute of Shandong Province，Qingdao 266104，China；3.Qingdao Engineering Laboratory of Exploration and Utilization of Marine Germplasm Resources，Qingdao 266104， China )

The mitochondrial DNA COⅠsequences were detected in snailBullactaexaratafrom seven populations in Liaoning, Shandong, Jiangsu and Zhejiang provinces insight on genetic diversity and population structure to understand mechanism of the genetic diversity and to protect snail germplasm resources. The analysis of 145 pieces of fragments with the length of 631 bp revealed that the average contents of A, G, T, C, and A + T were 23.83%, 18.93%, 41.60%, 15.64%, and 65.43%, respectively and AT level higher than the GC content. The number of haploid genotype was 47 sharing type haploid number of 12. AMOVA analysis showed that the total genetic differentiation coefficient of COⅠ (Fst) from seven groups was 0.7893 (P<0.001), the genetic differentiation among populations was greater than that within population. The phylogenetic evolution tree constructed by NJ showed that individuals from seven geographic populations stayed together with each other and the same group had no obvious independent aggregation. Molecular variance analysis manifested that obvious genetic differentiation appeared between groups.

Bullactaexarata; mitochondrial DNA COⅠ; genetic diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.016

S917

A

1003-1111(2017)03-0353-06

2016-03-14；

2016-07-28.

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201305027)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題項目(2014-2016)； 中海油公益基金資助項目(2015-2017)；青島市市南區(qū)科技發(fā)展項目(2014-14-094-2H).

趙丹(1991-)，女，研究生；研究方向：動物遺傳育種. E-mail:sdhzmdzd@163.com.通訊作者： 劉洪軍(1964-)，男，研究員；研究方向：漁業(yè)資源. E-mail:yzskyk@126.com.