楊 念徐華明胡文文苗玉芳

（1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑一科，鄭州 450008；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)科技處，鄭州 450046）

一種治療慢性肝損傷的中藥組合物※

楊 念1徐華明2*胡文文1苗玉芳2

（1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑一科，鄭州 450008；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)科技處，鄭州 450046）

目的探討一種治療四氯化碳（CCL4）誘導(dǎo)的小鼠慢性肝損傷的中藥組合物的作用，為研究中藥組合物治療慢性肝病分子的機(jī)制及其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法 ICR小鼠60只，隨機(jī)分為6組，對照組為（A），模型組為（B），中藥組合物低劑量組、中劑量組、高劑量組分別為（C、D、E），陽性藥組為(F)。A組腹腔注射橄欖油，B、C、D、E、F各組腹腔注射CCL4和橄欖油的混合溶液，每周2次，連續(xù)11周。治療時A組、B組給予0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC），C、D、E組給予不同濃度的中藥組合物和0.5%CMC的混懸劑，F(xiàn)組給予甘利欣和0.5%CMC的混合液。治療后采用賴氏法檢測小鼠外周血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的含量。采用蘇木精-伊紅染色方法觀察病理學(xué)變化。結(jié)果 C、D、E組外周血中ALT、AST與B組相比其含量明顯下降；C、D、E組肝臟病理變化與B組相比得到顯著改善；結(jié)論 中藥組合物能降低小鼠慢性肝損傷外周血中ALT、AST的含量，改善肝臟組織病理學(xué)變化。中藥組合物對小鼠慢性肝損傷有保護(hù)作用。

中藥組合物；ALT；AST；病理學(xué)

肝硬化是由各種因素導(dǎo)致的慢性肝損害的一類晚期肝纖維化疾病，是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，進(jìn)一步發(fā)展到失代償期會出現(xiàn)肝脾功能亢進(jìn)、消化道出血、肝功能衰竭甚至癌變，危及患者生命，是各種慢性肝病發(fā)展的晚期階段，由一種或多種病因反復(fù)或長期作用形成的彌漫性肝損害[1]，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為世界性的難題。本研究通過小鼠腹腔注射四氯化碳（CCL4）橄欖油溶液的方法，探討中藥組合物對慢性肝損傷的治療作用，為其作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ICR小鼠60只，雌雄各半，體重18~22 g，由鄭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，中藥組合物購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）購自南京建成生物工程研究所，一抗a-sma，內(nèi)參：抗GAPDH抗體購自Epitomics公司，RIPA裂解液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，二抗（羊抗兔）及相應(yīng)S-P試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組、模型建立及給藥方法 ICR小鼠60只，隨機(jī)分為6組，即對照組、模型組、中藥組合物低中高3個劑量組、陽性組各10只。普食普水飼養(yǎng)1周后造模，如下表1所示進(jìn)行造模。

表1 動物分組、造摸濃度、次數(shù)及時間

造模結(jié)束各組開始灌胃治療，按0.15 mL/10 g體重給藥，用蒸餾水配制成0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC），0.5%的CMC作為中藥組合物和甘利欣的混懸劑。配制：C組：50 mg/mL，D組：100 mg/mL，E組：150 mg/mL，F(xiàn)組：甘利欣67.5 mg/mL。A組和B組灌胃0.5%的CMC。各組按上述劑量灌胃1個月，在末次給藥結(jié)束24 h后殺鼠取材。

1.2.2 指標(biāo)檢測與方法 摘眼球取血法采集小鼠血液，放在EP管中，在4℃冰箱里靜置2 h左右，3500 r離心20 min，取上清檢測，進(jìn)行ALT、AST酶含量的檢測。測定方法參照試劑盒說明書。打開腹腔把肝臟標(biāo)本取出，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用（x±s）表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析 (analysis of variance，ANOVA)，組間比較采用t檢驗(yàn)。p＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01代表差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 中藥組合物對小鼠外周血中ALT、AST含量的影響 B組外周血中ALT含量升高，與A組相比p＜0.01；C組ALT含量下降，與B組相比p＜0.05，D組、E組、F組ALT含量下降，與B組相比p＜0.01。B組AST含量升高，與A組相比p＜0.01，C組AST含量下降，與B組相比p＜0.05，D組、E組、F組AST含量下降，與B組相比p＜0.01。見表2。

表2 中藥組合物對小鼠慢性肝損傷外周血中ALT、AST含量的影響 (x±s，卡門氏單位)

2.2 中藥組合物對小鼠慢性肝損傷病理形態(tài)學(xué)的影響 通過HE染色，如下圖1所示各組的病理變化，其中對照組（A）小鼠肝組織無病變，肝組織內(nèi)肝細(xì)胞胞漿豐富、無明顯脂肪變性及水變性，中央靜脈呈放射狀排列，肝細(xì)胞排列整齊。模型組（B）肝組織嚴(yán)重破壞，多個中央靜脈周圍炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞點(diǎn)狀壞死。膽管周圍膽汁淤積較嚴(yán)重，固縮的核較多，點(diǎn)狀壞死多，嗜酸性形成。假小葉形成，肝組織小葉內(nèi)、小葉間有大量炎性細(xì)胞浸潤，小葉結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性、部分肝細(xì)胞水樣變性，排列紊亂，中藥組合物各劑量組（C、D、E） 肝細(xì)胞脂肪出現(xiàn)輕微變性，內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞浸潤。并逐漸恢復(fù)整齊排列。甘利欣組 (F)部分肝細(xì)胞水變性，內(nèi)有散在炎癥細(xì)胞浸潤。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化（HE染色，10×10）

3 討論

肝病作為一種常見疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康，若在早期階段予以及時有效的治療，不僅可以防止其進(jìn)一步病變?yōu)楦斡不?、肝癌，還可以避免一些并發(fā)癥的出現(xiàn)，選擇與人類慢性肝病相似的動物模型不僅是研究疾病發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)，也是臨床評價診斷和治療方法的有效手段。CCL4誘導(dǎo)慢性肝損傷的機(jī)理是直接損害肝細(xì)胞，破壞細(xì)胞的各種成分，造成肝細(xì)胞的脂肪變性和壞死[2]。AST、ALT主要分布在肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞壞死，ALT、AST含量升高，并且其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致[3]。本實(shí)驗(yàn)選用HE染色檢測肝臟的病理變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)腹腔注射CCL411周后，小鼠的肝臟出現(xiàn)脂肪變性和肝硬化，包括肝小葉界限不清，胞質(zhì)內(nèi)還可見多個大小不等的脂肪空泡，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝竇變窄。中醫(yī)藥具有獨(dú)特的療效和巨大的開發(fā)潛能，應(yīng)用其治療肝硬化引起了人們的廣泛關(guān)注，該中藥組合物成分簡單，生化指標(biāo)檢測和病理學(xué)HE染色結(jié)果也充分證實(shí)了此結(jié)果，藥效學(xué)很明顯。

[1]林文健，李婕，郭芬芬，等.大鼠肝硬化模型建立探討[J].嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志，2017，22（4）：310-312.

[2]翟偉，刁廣浩，李瑞生，等.不同濃度CCl4注射聯(lián)合飲用乙醇誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型研究[J].實(shí)用肝臟病雜志，2016，19(6)：713-714.

[3]王穎，王帥，包永睿，等.復(fù)方木雞顆粒對CCl4誘導(dǎo)大鼠肝硬化的防治作用[J].中成藥.2017，39（3）：597-601.

[4]曹海芳，祖紅梅，彭軍寧，等.中西醫(yī)結(jié)合治療肝硬化合并上消化道出血臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)，2017，44（9）：1923-1924.

[5]劉有，張曉歡，白劍，等.肝纖維化模型中小鼠肝臟的病理變化及軟肝沖劑的治療作用[J].實(shí)用藥物與臨床，2016，19（7）：814-818.

[6]王朝陽，劉光偉.鱉甲煎丸治療早期肝硬化及并發(fā)癥的研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2017，32（13）：1986-1989.

[7]馬婷，田江，崔鳳榮，等.扶正化瘀片聯(lián)合西藥治療慢性肝炎肝硬化的臨床療效[J].遼寧中醫(yī)雜志.2017，44(9)：1927-1929.

A Kind of Traditional Chinese Medicine Composition for Treating Chronic Liver Injury

YANG Nian1,XU Huaming2,HU Wenwen1,MIAO Yufang2
(1.Pharmacy Department,the Third Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine,Henan Province,Zhengzhou 450008,China;2.Science and Technology Department,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Henan Province,Zhengzhou 450046,China)

Objective To investigate the effect of a traditional Chinese medicine composition on chronic liver injury induced by CCL4in mice,and to provide theoretical basis for studying the molecular mechanism and clinical application of traditional Chinese medicine composition in the treatment of chronic liver diseases.Methods 60 ICR mice were randomly divided into 6 groups,control group (A),model group (B),Chinese medicine combination of low dose group,middle dose group,high dose group (C,D and E)respectively,and the positive drug group (F).Group A was injected with olive oil by intraperitoneal injection,and group C,group D,group E and group F were injected with a mixture of carbon tetrachloride and olive oil twice a week for eleven weeks.After that,group A and B were given 0.5%sodium carboxyl methyl cellulose (CMC),group C,group D and group E were given different concentrations of Chinese medicine composite suspension agent and 0.5%CMC,group F was given a mixture of glycyrrhizic acid and 0.5%CMC.The contents of ALT and AST in peripheral blood of mice were detected by lai's method after treatment.The pathological changes were observed by using the hematoxylin staining method.Results The contents of ALT and AST of group C,group D and group E were significantly decreased comparing with the group B in the peripheral blood of the Chinese medicine composition group.The pathological changes of hepatic lesion in different dosage groups of group C,group D and group E were significantly improved comparing with the group B.Conclusion The contents of ALT and AST in the peripheral blood of mice with chronic liver injury in mice can be decreased by Chinese medicine composition,improve the pathological changes of liver tissues.Chinese medicine composition has protective effect on chronic liver injury in mice.

Chinese medicine composition;ALT;AST;pathology

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.23.066

1672-2779（2017）-23-0148-03

河南省科技攻關(guān)規(guī)劃項(xiàng)目【No.162102310454】；河南中醫(yī)藥大學(xué)科研苗圃工程項(xiàng)目【No.MP2016-31】

*通訊作者：hnzyyn@163.com

2017-09-29）