柯野,朱艷媚,余國興,葉杰洲,劉玉萍,劉圓圓,朱永麗

(韶關學院英東生命科學學院，廣東 韶關 512005)

羽毛降解菌株Streptomyces sp.DJ產(chǎn)生的蛋白酶酶學性質

柯野,朱艷媚,余國興,葉杰洲,劉玉萍,劉圓圓,朱永麗

(韶關學院英東生命科學學院，廣東 韶關 512005)

從羽毛廢棄物堆的土壤中采集樣品，通過富集培養(yǎng)、初篩和復篩分離出一株高效降解羽毛的DJ菌株；對該菌株的形態(tài)學觀察和基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進化分析，初步鑒定為鏈霉菌Streptomycessp. DJ。該菌株在32 ℃搖床培養(yǎng)10 d后，對天然羽毛的降解率高達50%，且羽毛水解產(chǎn)物中含有多種自由氨基酸。該菌株產(chǎn)生的蛋白酶最適反應溫度為45 ℃，最適反應pH為10.0；對羽毛的降解能力高于商品化的堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，對疏水性或親水性的自然底物也具有較強的水解能力。以上結果表明：DJ菌株及其產(chǎn)生的蛋白酶具有良好的應用潛力。

羽毛降解菌株；分離鑒定；酶學性質

近年來，隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，每年都有上百萬頓的廢棄羽毛產(chǎn)生[1]。對于廢棄羽毛的處理方式通常為填埋、焚燒或掩埋等簡單的處理方式[2]，廢棄羽毛常導致各種類型疾病(如萎黃、支原體病和禽霍亂等)相互傳染[3]；這造成蛋白質浪費和嚴重的環(huán)境污染。羽毛以角蛋白為主的w(粗蛋白)占90%以上，w(氨基酸)在70%以上，包括動物所需的多種必需氨基酸；角蛋白富含α-螺旋和β-螺旋，是由二硫鍵、氫鍵和疏水鍵等交聯(lián)而成的不溶性纖維蛋白。一般不易被木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白酶水解；因此，較難被動物直接消化利用[4-6]。常采用物理、機械和化學方法對羽毛降解，這易使必需氨基酸受到破壞，降低了降解產(chǎn)物的質量和效率[7]。利用微生物酶降解羽毛，避免以上的不足，高效地生產(chǎn)稀有氨基酸、肽等產(chǎn)品，應用于皮革工業(yè)、醫(yī)藥、化妝品等多種行業(yè)；這促進羽毛的深加工發(fā)展，并且還具有保護環(huán)境、變廢為寶的作用[8]。

從自然界分離獲得30多種可降解羽毛的微生物，這些微生物包括細菌、放線菌和真菌[6,9]。多數(shù)真菌產(chǎn)生的角蛋白酶具有致病性[3]，因此，多數(shù)研究集中在放線菌和細菌。目前獲得的羽毛降解菌多數(shù)對羽毛的降解效率低，需對羽毛進行前處理等不足；因此，篩選出對羽毛降解效率高，羽毛前處理簡單的微生物菌株更具有實用性。本文旨在篩選獲得高效降解羽毛的菌株，提高羽毛降解效率，為酶法生產(chǎn)獲得系列羽毛降解產(chǎn)品、促進羽毛深加工的高值化提供理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 羽毛與菌株來源 羽毛粉：采購于韶關市三鳥市場的天然羽毛，剪碎備用。菌株來源：韶關市養(yǎng)雞場的土壤、三鳥市場廢棄羽毛堆的土壤、三鳥市場廢水溝的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：NH4Cl 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO40.3 g/L，KH2PO40.4 g/L，MgCl20.1 g/L，酵母提取物1.0 g/L，羽毛粉10.0 g/L，未剪碎的羽毛少量，pH 7.5。羽毛粉平板：K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，無水CaCl20.025 g/L，F(xiàn)eSO40.015 g/L，羽毛粉10.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 0.15 g/L，KH2PO40.54 g/L，K2HPO40.09 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，無水CaCl20.005 g/L，未處理羽毛50.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH自然。LB培養(yǎng)基：NaClw=1.0%，蛋白胨w=1.0%，酵母提取物w=0.5%，pH 7.0。

1.1.3 生化與化學試劑等 PCR反應的酶與引物購自上海生工公司；半胱氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸購自廣州普博欣生物科技有限公司；甘氨酸、酪氨酸、谷氨酸購自上海展云化工有限公司；高效薄層層析硅膠板HSGF254(5×10)購自煙臺江支硅膠開發(fā)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 羽毛降解菌的分離篩選

1) 羽毛降解菌的平板分離。

分別取5.0 g土壤樣品接種于富集培養(yǎng)液中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)3 d；取少量培養(yǎng)液，稀釋液涂布于羽毛粉平板上，37 ℃培養(yǎng)7 d，挑取生長勢強的菌株劃線接種于羽毛粉平板上，37 ℃培養(yǎng)；反復劃線至挑取到單菌落為止。

2) 羽毛降解菌的發(fā)酵篩選。

將菌株接種于LB培養(yǎng)液中，37 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，將菌液接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，接種量為1%(V/V)，37 ℃、160 r/min培養(yǎng)8 d，用Whatman濾紙過濾發(fā)酵液，50 ℃烘干，稱量殘留羽毛質量。無菌水代替菌液作為對照。羽毛降解率=[(制備發(fā)酵培養(yǎng)基的羽毛干質量-發(fā)酵后殘留羽毛的干質量)/制備發(fā)酵培養(yǎng)基的羽毛干質量]×100%。

1.2.2 菌株的鑒定

1)菌體的形態(tài)觀察。

對DJ菌株的菌落形態(tài)進行觀察；并通過單染色，鏡檢觀察其菌體結構形態(tài)。

2) 16S rDNA分子鑒定。

將DJ菌株接種于LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h，收集菌體。參考酵母DNA的快速分離方法[10]，提取其基因組DNA。以提取的基因組為模板，進行16S rDNA的PCR擴增。PCR反應體系：DNA模板1 μL，上游引物2 μL(8-27F: 5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′)，下游引物2 μL(1523-1504R: 5′-AAGG AGGTGATCCAGCCGCA-3′)[11]，水 20 μL，2×HiFi-PCR Master 25μL，總體積50 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，29個循環(huán)；72 ℃恒溫5 min。對PCR產(chǎn)物電泳鑒定，純化回收測序分析。

1.2.3 發(fā)酵時間對羽毛降解的影響 將DJ菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、160 r/min、培養(yǎng)48 h，以1.0%(V/V)的接種量接種菌液于裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，32 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)，取不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液，測其pH、蛋白酶酶活，以及殘留羽毛的重量來計算羽毛的降解率。

1.2.4 羽毛水解產(chǎn)物中的氨基酸分析 利用TLC法，取培養(yǎng)8 d后發(fā)酵培養(yǎng)液進行過濾，收集濾液，60 ℃恒溫干燥濃縮后，向濃縮液中加入2.5倍的無水乙醇，20 ℃放置30 min，12 000 r/min離心，收集澄清的上清液，采用正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2的混合液作為展開劑進行TLC薄膜層析，采用茚三酮法顯色。

1.2.5 發(fā)酵液中蛋白酶的酶學性質研究

1) 粗酶液的制備。

對發(fā)酵液過濾，收集濾液，11 000 r/min離心10 min，收集上清液；添加硫酸銨使其飽和度達到80%以上進行鹽析后，11 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用蒸餾水溶解，透析獲得粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩y定粗酶液中蛋白酶的活性參考文獻[12]略有改動，即具體的方法為：取適當稀釋后的100 μL粗酶液和100 μL 2.0%酪蛋白(pH 10.0)，40 ℃中水浴10 min，然后加入200 μL三氯乙酸，水浴20 min后，12 000 r/min離心10 min，取300 μL上清依次加入1.5 mL Na2CO3和300 μL福林酚試劑，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20 min后在660 nm測其吸光度。以先加三氯乙酸滅酶活性的方式作為對照。酶活單位定義為：40 ℃反應溫度下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。

2) 最適反應溫度和最適反應pH。

測定酶液在30、35、40 、45 、50 、55 和60 ℃反應溫度下的活性，以確定最適反應溫度；測定反應pH為3.0、6.0、8.0、10.0和11.0的活性，以確定最適合反應pH。

3) 金屬離子與抑制劑對活性的影響。

分別向粗酶液中添加K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Mn2+、PMSF、EDTA和SDS，室溫下放置30 min后，測定其活性。以未添加試劑的酶液作為對照。

4)3種蛋白酶對羽毛降解的比較。

稱取5.0 g潔凈羽毛裝入三角瓶中，然后加70 mL蒸餾水潤濕羽毛，121 ℃滅菌20 min，冷卻后分別加入粗酶液(反應pH 10.0，溫度45 ℃)、木瓜蛋白酶(反應pH 7.2，溫度45 ℃)和堿性蛋白酶(反應pH 10.0，溫度45 ℃) 各30 mL酶液(酶活力為160 U/mL)，水解2 d，測其對羽毛的降解率。

5) 對不同自然底物的水解。

按蛋白酶活性的測定方法，分別以酪蛋白、BSA、明膠和大豆分離蛋白為底物，測定酶液的活性，探究對不同底物的水解活性。為了直觀地觀察，將水解產(chǎn)物置于沸水中5 min使酶失活，12 000 r/min離心10 min 收集上清液，進行w=12% SDS-PAGE凝膠電泳，染色觀察。

2 結 果

2.1 羽毛降解菌的篩選分離

將土壤樣品中的羽毛降解菌株進行富集培養(yǎng)后，把富集培養(yǎng)液稀釋涂布于羽毛粉平板上培養(yǎng)；進一步反復劃線分離，篩選出27株長勢較強的菌株。分別將27株菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后，測定比較菌株間對羽毛的降解率，從中篩選出長勢強、降解羽毛效率最高的DJ菌株。

2.2 DJ菌株的鑒定

DJ菌株在羽毛粉平板生長1 d為白色小菌落，菌落邊緣為淺白色；培養(yǎng)2 d菌落變?yōu)榛揖G色，菌落表面干燥，有土腥味，該菌株的菌落形態(tài)見圖1。鏡檢可見絲狀菌絲體，彎曲的孢子絲和球狀的孢子(見圖2)。對DJ菌株提取基因組DNA，以其為模板擴增16S rDNA基因，PCR產(chǎn)物約1 500 bp，對PCR產(chǎn)物測序；據(jù)測序結果利用GenBank數(shù)據(jù)中Blastx程序比對，進一步利用Mega 5.0軟件構建進化樹。綜合DJ菌株的菌落特征、菌絲體形態(tài)、以及16S rDNA序列分析，初步鑒定DJ菌株為Streptomycessp. DJ。

2.3 發(fā)酵時間對羽毛降解的影響結果

發(fā)酵培養(yǎng)DJ菌株1 d后，培養(yǎng)液逐漸渾濁，羽毛有降解跡象；培養(yǎng)6～7 d，羽片明顯被降解；培養(yǎng)8 d后，羽片和羽枝幾乎完全降解，僅余幾支最粗大的羽軸，發(fā)酵液變?yōu)辄S褐色，具有明顯刺鼻的氨味。發(fā)酵4 d的羽毛降解效果見圖3，由圖3可見，處理的羽毛明顯地被降解，對照的羽毛未出現(xiàn)明顯的降解跡象。

不同發(fā)酵時間對羽毛降解效果見表1。由表1可知，當DJ菌株在羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，羽毛的降解率幾乎達到最高，10 d后降解率趨向穩(wěn)定(約50%)；發(fā)酵液的pH值逐漸升高，當達到8 d時發(fā)酵液pH達到最高9.1，而后pH逐漸降低趨于穩(wěn)定。發(fā)酵液中胞外堿性蛋白酶的活性逐漸增加，后期逐漸降低。

2.4 羽毛水解產(chǎn)物的氨基酸分析結果

將羽毛發(fā)酵液通過濃縮，去掉大分子蛋白后進行薄層層析(TLC)，層析結果見圖4。由圖4可知，羽毛水解產(chǎn)物中可能含有半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸等自由氨基酸。

表1 不同發(fā)酵時間對羽毛的降解率Table 1 Effects of incubation period on feather degradation by DJ strain grown in shake culture

圖1 DJ菌株在羽毛粉平板上的菌落圖Fig.1 Colonies of DJ strain growing on feather meal plate

圖2 溝DJ菌株的顯微圖Fig.2 Cell morphology of DJ strain

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)中羽毛的降解圖Fig.3 Degradation of feathers by DJ strain (a,b: 左邊三角瓶為處理，右邊三角瓶為對照)

圖4 羽毛水解產(chǎn)物中的氨基酸TLC圖Fig.4 Thin layer chromatography (TLC) plate showing amino acids composition of feather hydrolysate樣:發(fā)酵液樣品; Gly:甘氨酸; C:半胱氨酸; T: 酪氨酸; P:脯氨酸; V:纈氨酸; S:絲氨酸; M:甲硫氨酸; Glu:谷氨酸

2.5 粗酶液的酶學性質結果

2.5.1 最適反應溫度和最適反應pH結果 反應溫度和反應pH對蛋白酶活性的影響分別見圖5和圖6。圖5可見，蛋白酶最適反應溫度為45 ℃；當溫度低于40 ℃或高于55 ℃，活性顯著下降，不到最適反應溫度活性的80%，這表明反應溫度對酶活性影響極顯著。由圖6可見，隨著反應pH升高，酶活性逐漸提高，最適pH為10.0；當反應pH高于10.0時，活性降低。

2.5.2 金屬離子與抑制劑對活性的影響結果 不同金屬離子和抑制劑對活性的影響結果見表2。由表2可知，K+、Ca2+Na+和Mg2+對活性具有一定的促進作用；Mn2+對活性有顯著地促進作用，能提高活性60%。螯合劑EDTA和抑制劑PMSF能顯著地抑制活性，分別使活性僅保留28.9%和55.0%。

2.5.3 3種蛋白酶對羽毛降解的比較結果 3種蛋白酶對羽毛降解結果見表3。由表3可見，粗酶液對羽毛降解率達到20.9%，堿性蛋白酶的降解率為8.8%，而木瓜蛋白酶幾乎不能降解羽毛；該結果表明粗酶液對羽毛的降解效果明顯高于商品化木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，具有較強的應用價值。

圖5 反應溫度對酶活的影響Fig.5 Effects of temperature on the protease activity

圖6 反應pH對酶活的影響Fig.6 Effects of pH on the protease activity

試劑濃度/mmol相對酶活/%無試劑001000K+101031Ca2+101068Na+101079試劑濃度/mmol相對酶活/%Mg2+101103Mn2+101600EDTA10289PMSF10550

表3 3種蛋白酶對羽毛降解效果
Table 3 Effects of 3 kinds of proteases on feather degradation

酶種類粗酶液堿性蛋白酶木瓜蛋白酶羽毛降解率/%2098805

2.5.4對不同自然底物的水解結果 對不同底物的水解結果見表4。由表4可知，蛋白酶對酪蛋白的水解能力最強，次之是大豆分離蛋白(48.5%)、較差為明膠(26.9%)，最差是BSA(15.7%)。蛋白酶對4種底物的水解產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖(見圖7)。由圖7可見，蛋白酶對酪蛋白和大豆分離蛋白的水解效果較好，水解產(chǎn)物中的蛋白條帶不明顯；而對BSA的水解效果較差，水解產(chǎn)物中有大量的不同分子量的蛋白條帶，該電泳圖與測定水解活性結果一致。

表4 不同自然底物的水解結果Table 4 Hydrolysis effects of different natural substrates

圖7 4種底物的水解產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE analysis of the hydrolysates of 4 natural substrates1:明膠(-)；2:明膠(+)；3:BSA(-)；4:BSA(+)；5:酪蛋白(-)；6:酪蛋白(+)；7:SPI(-)；8:SPI(+)；M: 蛋白Marker

3 討 論

目前，從自然界中分離獲得對羽毛有降解作用的微生物已有報道，但是很少應用于工業(yè)；主要是這些微生物對羽毛的降解能力有限。究其原因是當w(羽毛粉)高于1.5%時，菌株產(chǎn)生的胞外蛋白酶被抑制，導致羽毛粉的降解效率降低[13]；這正如JAIN R等報道的StreptomycesexfoliatusCFS 1068菌株對w=0.5%的羽毛降解率為96.6%，對w=2.0%羽毛粉的降解率僅為72.1%[14]；王繼勇等分離的羽毛降解菌株對w=1.0%羽毛粉的最高降解率僅為71.3%[2]。本文分離的DJ菌株對w=5.0%的羽毛粉仍有51.2%的降解率，這表明該菌株比目前報道的多數(shù)菌株都具有較強的應用潛力。

DJ菌株產(chǎn)生的胞外酶能分別被EDTA和PMSF顯著地抑制活性，這表明DJ菌株分泌的胞外蛋白酶的活性中心與金屬離子和絲氨酸有關，且最適反應pH為10.0；該結果與朱友峰等報道的角蛋白酶可能是一種絲氨酸金屬蛋白酶，最適pH為9.0的結果相一致[1]。該酶與一般的內肽酶(堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶)相比，對羽毛具有極強的水解能力，羽毛水解產(chǎn)物中含有多種自由氨基酸；并且對內肽酶幾乎不能水解的親水性自然底物(如明膠和BSA)都具有較強的水解效果，這表明該酶具有廣泛的肽鍵選擇性，具有良好的開發(fā)價值和應用前景。今后將對該酶基因進行克隆表達、純酶的性質、結構與功能，以及對羽毛的降解機理等方面進行深入的研究。

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CharacteristicsofProteinasesProducedbyafeather-degradingStreptomycessp.DJStrian

KEYe,ZHUYanmei,YUGuoxing,YEJiezhou,LIUYuping,LIUYuanyuan,ZHUYongli

(Henry Fok College of Life Sciences, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China)

A DJ strain with a high efficience of feather-degrading capability was isolated from the soil of feather waste by the enrichment culture and the screening process．The strain was identified asStreptomycessp. according to morphologic observation, 16S rDNA sequence alignment, and phylogenetic trees analysis. After fermenting at 32 ℃ for 10 days, the feather degradation rate reached 50%, and the feather hydrolysate was found to contain amino acids. The protease produced by the DJ strain had a maximal activity at 45 ℃, and the optimum reactive pH at 10.0. The protease displayed a higher hydrolysis activity to feather than Alcalase and Papain, and had a strong hydrolysis ability to the hydrophobic or hydrophilic natural substrates. The results indicated that the DJ strain and its protease was of potential application prospects．

feather-degradingStreptomycessp. DJ strian; isolation and identification；characteristics of proteinases

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.06.23

2016-11-14

廣東省教育廳特色創(chuàng)新項目(2015KTSCX126)；韶關學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃省級項目(201710576032) ；韶關學院大學生科技創(chuàng)新培育項目(pdjh2017b0460)；廣東省科技計劃項目(2016A010105024)

柯野(1977年生)，男；研究方向微生物學和酶工程；E-mail:keye518@163.com

Q939.9

A

0529-6579(2017)06-0147-06