方 瑩，李雨念，王梅志，李佳冰，鐘藝萃，王海英

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護(hù)與綜合利用工程中心，武漢 430074)

櫻桃果實(shí)酶促褐變及其影響因素的研究

方 瑩，李雨念，王梅志，李佳冰，鐘藝萃，王海英

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護(hù)與綜合利用工程中心，武漢 430074)

以紅燈品種的櫻桃果實(shí)為材料，對(duì)果實(shí)中的多酚氧化酶(PPO)的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究.通過(guò)其與鄰苯二酚反應(yīng)后產(chǎn)物的吸光度值的測(cè)量，分別研究了櫻桃在不同儲(chǔ)存條件下褐變度的變化，以及溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間和氧化抑制劑L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸和肉桂酸等對(duì)PPO活性的影響. 結(jié)果表明：以0.01mol/L的鄰苯二酚作為底物，櫻桃果肉PPO分別在反應(yīng)溫度為10 ℃和pH值為4.0時(shí)的活性較高，反應(yīng)時(shí)間為10～15 min時(shí)活性較高，褐變程度較強(qiáng).在一定的條件下，幾種抑制劑對(duì)櫻桃果肉的PPO活性呈現(xiàn)出不同的抑制效果，以抗壞血酸的抑制效果為最佳.

櫻桃；酶促褐變；多酚氧化酶；抑制劑

櫻桃是某些李屬類(lèi)植物的統(tǒng)稱，包括櫻桃亞屬、酸櫻桃亞屬、桂櫻亞屬等.果實(shí)外表色澤鮮艷、晶瑩美麗、紅如瑪瑙、黃如凝脂，果實(shí)富含糖、蛋白質(zhì)、維生素及鈣、鐵、磷、鉀等多種元素.櫻桃一般于四五月成熟，由于采收期正值高溫季節(jié)，采摘后貯藏過(guò)程中果實(shí)容易失水皺縮、掉梗、褐變和腐爛，品質(zhì)極易敗壞，市場(chǎng)供應(yīng)期甚短.許多研究表明，果實(shí)中的多酚氧化酶(PPO)是果實(shí)發(fā)生酶促褐變，導(dǎo)致果實(shí)腐敗變質(zhì)的主要物質(zhì)，并且對(duì)水果加工產(chǎn)品如果汁、果酒等飲料的色澤、品質(zhì)和風(fēng)味有很大影響[1，2].

PPO是一類(lèi)含銅的氧化還原酶，可以用一元酚和二元酚作底物.在有氧的條件下，PPO將鄰位的酚氧化為醌，醌很快聚合成為褐色素而引起組織褐變[3-8].PPO的活性受溫度、pH值、底物濃度及作用時(shí)間等諸多因素影響，并且不同植物組織中各種因素的影響也各有不同. 對(duì)櫻桃酶促褐變機(jī)理的研究主要體現(xiàn)在對(duì)櫻桃果實(shí)中多酚氧化酶的活性研究以及找出抑制其活性的有效方法，本研究對(duì)櫻桃果實(shí)的保鮮、貯藏、運(yùn)輸以及副產(chǎn)品的生產(chǎn)加工有重要的理論價(jià)值及實(shí)際參考意義.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮無(wú)損的櫻桃果實(shí)購(gòu)自武漢農(nóng)貿(mào)市場(chǎng).鄰苯二酚、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、L-半胱氨酸、肉桂酸、抗壞血酸、檸檬酸等(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)均為分析純或化學(xué)純.

1.1.2 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-6100PC型，上海美譜達(dá)儀器有限公司)，電子天平(FA2004型,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(HC-3018R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，恒溫水浴鍋(HH-S型，常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠)，pH計(jì)(FE20型，梅特勒-托利多儀器有限公司).

1.2 PPO的提取

櫻桃洗凈去核后，按1∶1(w/v)比例加入預(yù)冷的0.05 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液，低溫?fù)v碎至勻漿，然后將勻漿液于6000 r/min下冷凍離心15 min，上清液即為酶的粗提液，低溫保存?zhèn)溆?

1.3 褐變度的測(cè)定

采用消光值法[9]測(cè)定.櫻桃果肉樣品10 g與冷卻蒸餾水按1∶10(w/w)混合并勻漿30 s后冷凍離心(6000 r/min，5 min)，取上清液于室溫和4 ℃條件下貯藏.0、2、4、6、8、10 d后取上清液部分于25 ℃保溫5 min，在410 nm測(cè)定其吸光度值，結(jié)果以A410表示褐變度.

1.4 不同影響因素對(duì)櫻桃果肉PPO活性的影響

1.4.1 溫度對(duì)PPO活性的影響

反應(yīng)體系包括0.05 mol/L pH 6.5的緩沖液3 mL，鄰苯二酚1 mL，粗酶液1 mL，該體系分別在10、20、25、30、40、50 ℃條件下反應(yīng)10 min，然后加入1 mL三氯乙酸終止反應(yīng)，測(cè)定其吸光度值.以吸光度值為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)，繪制曲線，以確定櫻桃果肉中PPO活性測(cè)定的最佳反應(yīng)溫度.

1.4.2 pH值對(duì)PPO活性的影響

配制不同緩沖液，使反應(yīng)體系的pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0.反應(yīng)體系包括緩沖液3 mL，粗酶液1 mL，鄰苯二酚1 mL.25 ℃保溫5 min，反應(yīng)后加入1 mL三氯乙酸終止反應(yīng)，于410 nm處測(cè)定其吸光度值.

1.4.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)PPO活性的影響

按上述取樣，反應(yīng)體系在25 ℃恒溫水浴中分別反應(yīng)5、10、15、20、30、40 min后測(cè)定吸光度值.作圖以確定櫻桃PPO活性測(cè)定的最佳反應(yīng)時(shí)間.

1.4.4 抑制劑對(duì)PPO活性的影響

吸取粗酶液1 mL，分別加入1 mL濃度為0.1%的L-半胱氨酸、肉桂酸、檸檬酸、抗壞血酸，室溫下振蕩混勻，再加入2 mL磷酸鹽緩沖液，1 mL 0.01 mol/L鄰苯二酚，于25 ℃水浴中反應(yīng)10 min，然后加入1 mL三氯乙酸終止反應(yīng)，測(cè)定其吸光度值.比較相同濃度下各抑制劑對(duì)櫻桃果肉PPO活性的影響[10].對(duì)照組中抑制劑的量由緩沖液替代之，其他做相同處理.

1.4.5 抗壞血酸濃度對(duì)PPO活性的影響

吸取粗酶液1 mL，分別加入1 mL濃度為0.0250%、0.0375%、0.0500%、0.1000%、0.2000%、0.3000%的抗壞血酸，室溫振蕩混勻.再加入2 mL磷酸鹽緩沖液，1 mL 0.01 mol/L鄰苯二酚，于25 ℃水浴中反應(yīng)10 min，然后加入1 mL三氯乙酸終止反應(yīng)，測(cè)定其吸光度值.比較不同濃度的抗壞血酸對(duì)櫻桃果肉PPO活性的抑制作用.

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃果實(shí)于貯藏期間褐變度(BD)的變化

櫻桃果肉在室溫和4 ℃貯藏條件下，BD均呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)(圖1)，表明切分可導(dǎo)致褐變現(xiàn)象的迅速發(fā)生，并且隨著時(shí)間增長(zhǎng)，褐變反應(yīng)會(huì)持續(xù)進(jìn)行[11，12].相比而言，室溫貯藏條件下櫻桃樣品的褐變程度顯著高于4 ℃貯藏條件下的櫻桃樣品，這說(shuō)明低溫保存對(duì)櫻桃酶促褐變有較明顯的抑制效果.此外，室溫下貯藏的櫻桃樣品4 d之前快速褐變，8 d之后進(jìn)入平臺(tái)期.這可能是因?yàn)闄烟易陨淼牡孜餄舛扔邢蓿炊喾宇?lèi)物質(zhì)隨時(shí)間消耗減少而使褐變反應(yīng)進(jìn)程減緩.

圖1 室溫和4 ℃下櫻桃果實(shí)褐變情況Fig.1 The change of browning degree in cherry fruits at room temperature and 4 ℃

2.2 溫度對(duì)櫻桃果肉PPO活性的影響

從圖2可知，櫻桃果實(shí)PPO在10 ℃呈現(xiàn)最大的PPO活性，隨著溫度的上升，PPO活性總體呈下降趨勢(shì)，但于20～25 ℃溫度范圍內(nèi)維持在較穩(wěn)定的水平，超過(guò)25 ℃以上時(shí)櫻桃果肉PPO活性呈明顯下降趨勢(shì)，這同許多果蔬的PPO的最適溫度為25～45 ℃之間的結(jié)果有所不同，如火龍果和蓮藕中PPO的活力分別在30 ℃和35 ℃時(shí)達(dá)到最高值，鮮切山藥中PPO的活力則在45 ℃時(shí)達(dá)到最高[3，9,11].這說(shuō)明鮮切櫻桃果肉中的PPO活力對(duì)溫度的敏感性與其他果蔬的PPO之間存在一定的差異，耐熱性較差，其具體機(jī)理仍有待進(jìn)一步的探究.

圖2 溫度對(duì)櫻桃PPO活性的影響Fig.2 The effect of temperature on activity of cherry PPO

2.3 pH值對(duì)櫻桃果肉PPO活性的影響

隨著體系酸度的降低，櫻桃果肉PPO活性最初有微弱的增大趨勢(shì)(圖3)，在pH值為4.0時(shí)有一個(gè)吸收峰，而當(dāng)繼續(xù)增大反應(yīng)的pH值時(shí)，櫻桃果肉PPO活性明顯下降，于pH 5.0～7.0范圍內(nèi)下降變化率最大；pH在8.0之后進(jìn)入穩(wěn)定期.該結(jié)果表明，櫻桃果肉PPO的活性對(duì)pH值的變化較為敏感，且其最適pH值為4.0.

圖3 pH值對(duì)PPO活性的影響Fig.3 The effect of pH value on activity of PPO

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)櫻桃果肉PPO活性的影響

由圖4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值呈上升趨勢(shì)，這表明櫻桃果肉的酶促褐變反應(yīng)在該時(shí)間段內(nèi)在持續(xù)進(jìn)行，醌類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生使得褐變度增加.相比而言，反應(yīng)時(shí)間在15 min之前褐變?cè)鲩L(zhǎng)速度較快，約20 min之后增長(zhǎng)速度減慢.可能原因一方面是櫻桃PPO活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而變?nèi)?，另一方面是底物濃度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低.

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)PPO活性的影響Fig.4 The effect of reaction time on PPO activity

2.5 抑制劑對(duì)櫻桃果肉PPO活性的影響

相同濃度的抗壞血酸、肉桂酸、L-半胱氨酸、檸檬酸對(duì)櫻桃PPO活性均有一定的抑制作用(圖5)(p<0.05)，且抗壞血酸與L-半胱氨酸的抑制作用較強(qiáng)，肉桂酸與檸檬酸的抑制作用較弱.抗壞血酸與L-半胱氨酸具有顯著性差異(p<0.05).因此，可以初步判斷幾種抑制劑對(duì)櫻桃PPO活性的抑制效果依次為：抗壞血酸>L-半胱氨酸>肉桂酸>檸檬酸.該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果存在一定差異，推測(cè)不同水果的PPO存在一定的種屬特異性.

圖5 不同抑制劑對(duì)PPO活性的影響Fig.5 The effects of different inhibitors on the activity of PPO

2.6 抗壞血酸濃度對(duì)PPO活性的影響

抗壞血酸對(duì)櫻桃PPO活性的抑制作用最佳，進(jìn)一步研究不同濃度的抗壞血酸對(duì)櫻桃PPO活性的影響情況.圖6的結(jié)果表明，濃度為0.1%的抗壞血酸抑制效果最佳，此后若繼續(xù)增加濃度，抑制效果在濃度為0.2%時(shí)略有減弱，在濃度為0.3%時(shí)抑制效果又有一定增強(qiáng).從食品安全和經(jīng)濟(jì)成本的角度出發(fā)，添加劑用量也不宜過(guò)多.因此，抗壞血酸的添加量以濃度為0.1%為宜.

圖6 抗壞血酸濃度對(duì)PPO活性的影響Fig.6 The effect of ascorbic acid concentration on the activity of PPO

3 結(jié)語(yǔ)

多酚氧化酶(PPO)一直被公認(rèn)為是引起鮮切果蔬酶促褐變的主要酶類(lèi)[13].由于不同果蔬中多酚氧化酶的酶學(xué)特性及其底物各不相同，不同種類(lèi)或品種的果蔬中PPO的活性及其反應(yīng)條件存在一定的品種特異性[14].

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，櫻桃果肉在4 ℃時(shí)褐變度明顯低于室溫，且褐變不明顯. 當(dāng)溫度上升到10 ℃時(shí)，PPO活性顯著增加，在10～25 ℃之間維持在較高水平，此后逐漸降低，說(shuō)明櫻桃果肉PPO的耐熱性較差.此外，櫻桃PPO在pH為3.0～5.0時(shí)活性較高， pH值4.0時(shí)達(dá)到峰值， pH值大于8.0時(shí)PPO活性抑制效果明顯.反應(yīng)時(shí)間在10～15 min時(shí)褐變快速發(fā)生，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，吸光值也逐漸增加.4種抑制劑對(duì)櫻桃PPO均有不同程度的抑制作用，以抗壞血酸的抑制效果最佳.因此，在櫻桃果醬、果酒、果干、果汁等副產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)中，可采用瞬時(shí)高溫、適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值、控制反應(yīng)時(shí)間以及適度添加濃度適宜的抗壞血酸等方法，合理降低櫻桃果肉中多酚氧化酶的活性從而控制其褐變度，進(jìn)而提高商品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.

[1] 閆真真.櫻桃酒褐變機(jī)理及釀造技術(shù)研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[2] 羅佳麗.鮮切紫薯褐變機(jī)理及控制技術(shù)研究[J].重慶：西南大學(xué)，2013.

[3] 李粉玲,蔡漢權(quán),陳 艷,等.火龍果果肉的酶促褐變及其抑制措施[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,46(6)：999-1002.

[4] 謝筆鈞.食品化學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，2005:357-359.

[5] 趙玉娥，李瑞芬.生物化學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:46-53.

[6] 詹嘉紅.橄欖果實(shí)中PPO和PDO活性抑制研究[J].亞洲熱帶植物科學(xué)，2005(4)：14-16.

[7] 劉 超，汪曉鳴，王 宏.輻照對(duì)梨汁多酚氧化酶活性的抑制作用[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2006,20(4):331-332.

[8] 劉桂明，張懷宇，鄧海陽(yáng)，等.榨菜中多酚氧化酶特性的研究[J].食品科學(xué)，2006,27(12)：182-185.

[9] 王青章，劉懷超，孫 頡.蓮藕貯藏中褐變度及多酚氧化酶活性的初步研究[J].中果蔬菜，1997，(3)：4-6.

[10] Guerrero-Beltran J A,Barbosa-Canovas G V,McEvily A J,et al.Inhibition of enzymatic browning in apple products by 4-hexylresorcionl,cysteine and acid[J].Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 2005,38:625-630.

[11] 郁志芳，彭貴霞，夏志華，等.鮮切山藥酶促褐變機(jī)理的研究[J].食品科學(xué)，2003,24(5):44-49.

[12] Asemota H N,Wellinington M A,odutuga A A， et al.Effect of short term storage on phenolic content odiphenolase and peroxi-dase activities of cutyam tubers[J].J Sci Food Agric,1992(60):309-312.

[13] 程 雙，胡文忠，馬 躍，等.鮮切果蔬酶促褐變機(jī)理及控制研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2009,25(4)：173-176.

[14] 詹嘉紅.枇杷果實(shí)酶促褐變控制研究[J].廣州食品工業(yè)科技，2004,20(4)：49-55.

StudyontheEnzymaticBrowninginCherry

FangYing,LiYunian,WangMeizhi,LiJiabing,ZhongYicui,WangHaiying

(Engineering Research Center for the Protection and Utilization of Bioresource in Ethnic Area of Southern China, College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

The enzymatic characteristics of Hongdeng cherry polyphenol oxidase(PPO)was preliminary studied by spectrophotometer using catechol as substrate. The change of browning degree in cherry fruits at room temperature and 4 ℃ and the effects of the pH, reactivity time, temperature and inhibitors such as L-cysteine, Vic, citric acide and 4-hydroxycinnamic acid were studied. The results showed that the optimum conditions as follow: pH is 4.0, the reaction temperature is 10 ℃,the time of reaction was 10～15 min.Under certain conditions, four kinds of inhibitors presents different inhibiting effect, and the optimum one is Vic.

cherry；enzymatic browning；polyphenol oxidase；inhibitor

2017-06-30

方 瑩(1987-)，女，講師，博士，研究方向：食品科學(xué)技術(shù)，E-mail：fangying19870808@163.com

湖北省自然科學(xué)基金資金(2015CFB519);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(CZQ14016); 湖北省戰(zhàn)略性新興(支柱)產(chǎn)業(yè)人才培養(yǎng)計(jì)劃(GJZ15001)

Q945.6+6

A

1672-4321(2017)04-0060-04