方芳，宋小雪，顧媛媛，郭玉巖，姚麗琴，田明*，高士平，賈永囡,鄭文韜

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

制劑工藝

星點設計-效應面法優(yōu)選穿山龍咀嚼片提取工藝

方芳1，宋小雪1，顧媛媛1，郭玉巖1，姚麗琴1，田明1*，高士平1，賈永囡1,鄭文韜2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：星點設計-效應面法優(yōu)選穿山龍咀嚼片提取工藝。方法：以乙醇濃度、提取時間、溶媒比為自變量，以薯蕷皂苷含量為因變量，通過對自變量各水平的多元線性回歸及二項式擬合，用效應面法選取出最佳工藝，并進行預測分析。結果：確定最優(yōu)提取工藝為8倍量，80%乙醇，提取2次，每次120 min，提取預測值與理論值偏差平均值為1.4%，二項式擬合復相關系數(shù)0.976 9。結論：星點設計-效應面法優(yōu)選的穿山龍咀嚼片提取工藝方法簡單，精密度高，可預測性較好。

穿山龍咀嚼片；星點設計；提取工藝

穿山龍為薯蕷科蕷薯屬植物穿龍薯蕷(DioscoreanipponicaMakino)的根莖，味甘、苦，性溫，歸肝、腎、肺經[1],主要在我國東三省、內蒙古等地分布[2]。現(xiàn)代已作為甾體激素藥物和抗冠心病皂苷類藥物的重要工業(yè)原料[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，其總皂苷類成分具有調節(jié)免疫、降血糖、改善心血管功能、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[4-6]。本文采用星點設計效應面法，優(yōu)選穿山龍藥材的乙醇提取條件，為穿山龍咀嚼片制劑提取工藝提供生產依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(ThermoU3000，美國Thermo公司；KQ-300V型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-ⅢA鄭州長城科技工貿有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(BC1，北京中西集團公司)；電熱恒溫干燥箱(DNP-9052，上海精宏實驗設備有限公司)；電子天平(JD1000-2，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司);旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52A)。

1.2 試藥

穿山龍(哈藥集團世一堂中藥飲片廠)；標準品薯蕷皂苷(北京世紀奧科生物技術有限公司，批號16062，供含量測定用)；乙醇為分析純，甲醇和乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 穿山龍薯蕷皂苷含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性研究

色譜柱：AcclaimTM120 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以乙腈-水(55∶45)為流動相；檢測波長為203 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫：25℃；理論塔板數(shù)按薯蕷皂苷峰計算應不低于2 000[3]。

2.1.2 對照品溶液的制備

取薯蕷皂苷對照品,精密稱定,加甲醇制成0.301 2 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 標準曲線的制備

分別精密量吸取上述對照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL注入液相色譜儀中，測定。以含量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程為：Y=3.863 8X-0.023 1，R2=0.999 9。結果表明薯蕷皂苷含量在0.612 4 μg～4.216 8 μg的范圍內與峰面積線性關系良好。見圖1。

圖1 薯蕷皂苷標準曲線

2.2 穿山龍?zhí)崛」に噧?yōu)化

2.2.1 實驗方法及星點試驗設計

取穿山龍生藥30 g，按照星點試驗設計安排實驗，得到20次實驗的提取液，分別將提取液適當濃縮，加乙醇定容于100 mL容量瓶中。精密量取1 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，濾過，定量轉移置10 mL容量瓶中，用于測定薯蕷皂苷含量。

考察因素為乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間和加醇量，因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理比較困難，結合工業(yè)生產的實際，暫固定為2次，其余因素的水平根據(jù)預實驗的結果而定。根據(jù)星點設計的原理，每因素設5個水平，用代碼-α、-1、0、1、α來表示。代碼值所代表的實際操作物理量見表1，實驗安排與結果見表2。

表1 穿山龍?zhí)崛」に噧?yōu)化星點試驗因素水平

表2 穿山龍?zhí)崛」に囆屈c試驗設計與結果

2.2.2 模型擬合

以薯蕷皂苷含量為因變量，運用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0以各因變量分別對自變量進行多元線性回歸、二項式擬合，并以相關系數(shù)(r)和置信度(P)為模型判定標準，選擇有較大 r 值和較優(yōu)P 值對方程進行優(yōu)化，得多元線性回歸方程：Y=7.76+0.17X1+3.22X2+0.49X3(R2=0.877 0,P<0.000 1)；二項式方程：Y=8.90+0.17X1+3.22X2+0.49X3+0.60X1X2+0.084X1X3+0.091X2X3-0.86X12-0.34X22-0.47X32(R2=0.976 9，P<0.000 1)。多元線性回歸復相關系數(shù)較低，表示模型擬合度不高，自變量與因變量間線性相關性較差，所以不宜用線性模型，而二項式回歸方程復相關系數(shù)較高，表明具體實驗因素對效應值的影響不是簡單的線性關系。最后選擇多元二項式擬合模型為成功模型，實測值和預測值基本吻合，有較好的預測作用。

2.2.3 效應面優(yōu)化與預測

根據(jù)優(yōu)化后的二項式方程，運用 Design-Expert 8 軟件作三維效應面圖，見圖2～4。由效應面圖2～4可知，選擇效應面圖上薯蕷皂苷含量大的區(qū)域，可求得提取工藝的最佳工藝參數(shù)，即當乙醇濃度在70%

圖2 乙醇濃度和提取時間對薯蕷皂苷含量的影響

圖3 乙醇濃度和加醇量對薯蕷皂苷含量的影響

圖4 提取時間和加醇量對薯蕷皂苷含量的影響

2.2.4 驗證試驗與結果

稱取10倍量(300 g)藥材，共3份。 按最佳工藝回流提取，分別合并提取液，取提取液的1/10濃縮定容至100 ml量瓶中，按2.2.1項下方法測定薯蕷皂苷含量。結果分別為11.945 6、11.995 8、12.035 9,驗證試驗結果與方程預測值比較，相對偏差[相對偏差=(預測值-實測值)/預測值]分別為1.7%、1.4%、1.0%，平均值約為1.4%。偏差都較小，表明所建立的數(shù)學模型具有良好的預測性，所選的條件重復性良好，證明該工藝可靠可行。

3 討論

穿山龍藥材主要含有甾體皂苷類化合物，薯蕷皂苷屬于難溶于水的甾體化合物，也是主要有效成分，以其為測定指標考察醇提取工藝參數(shù)，具有代表性[7-10]。本試驗采用了星點設計-效應面法對穿山龍?zhí)崛」に囘M行了優(yōu)化，設計方法簡單，試驗次數(shù)少，充分考慮到各因素的交互作用，在中心點進行重復試驗以提高試驗精度，同時采用了二項式回歸方程，相關系數(shù)及置信度均較好，預測值與試驗真實值接近，更符合實際，節(jié)約能源，提高了效率，結果穩(wěn)定、可靠，為下一步制劑成型工藝研究奠定了基礎。

[1] 張寧,于棟華,周琦,等.穿山龍藥理研究作用的研究進展[J].中國藥房,2015,26(4):547.

[2] 賈曉晴，尹海波，陶玲，等.不同產地穿山龍活性成分與環(huán)境因子相關性研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2017,44(4):820-824.

[3] 中國藥材公司.中國中藥資源志要[M].北京:科學出版社,1994:1414.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:267-268.

[5] 方芳，顧媛媛，郭玉巖，等.穿山龍降糖制劑的降糖藥理作用研究[J].中醫(yī)藥學報，2017,45(4):33-36.

[6] 劉樹民，張寧，周琦，等.藥理效應法測定穿山龍總皂苷的藥動學參數(shù)[J].中國實驗方劑學雜志，2016,22(16):76.

[7] 郭帥.穿山龍中薯蕷皂苷元衍生物的合成及體外活性篩選[D].長春：吉林農業(yè)大學,2016:9-18.

[8] 馮冰.甾體皂苷生物轉化及其特異性糖苷酶的研究[D].北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，2005:12-13.

[9] 胡湘春，魚紅閃，金鳳燮.穿山龍薯蕷皂苷的分離提純[J].大連輕工業(yè)學院學報，2004,23(1):25-29.

[10] 張小飛，劉潔瓊.大孔樹脂分離純化穿山龍薯蕷皂苷工藝實驗研究[J].中南藥學，2012，10(5)：321.

OptimalExtractionProcessofDioscoreanipponicaMakinoTabletsbyCentralCompositeDesignResponseSurfaceMethod

FANG Fang1, SONG Xiao-xue1, GU Yuan-yuan1, GUO Yu-yan1, YAO Li-qin1, TIAN Ming1, GAO Shi-ping1, JIA Yong-nan1, ZHENG Wen-tao2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFiratAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To optimize the extraction process ofDioscoreanipponicaMakinotablets by central composite design response surface method(ccd-rsm). Methods: Ethanol concentration, extraction time, solvent ratio were taken as independent variables with diosgenin content as dependent variable, through multiple linear regression and binomial fitting each level of independent variables, using the response surface method to select out the best technology, and carried on the forecast analysis. Results: The optimum extraction process was 8 times of 80% ethanol, twice extraction, each time for 120min, and the average deviation between the predicted and theoretical values was 1.4%, and the binomial fitting complex correlation coefficient was 0.976 9. Conclusion: Method of ccd-rsm was used to optimize the extraction process ofDioscoreanipponicaMakinotablets, the method has the characteristic of easiness, high precision, and good predictability.

DioscoreanipponicaMakinotablets; Central composite design; Extraction process

R284.2

A

1002-2406(2017)06-0085-03

2017-07-12

2017-08-10

哈爾濱市科學技術局科技創(chuàng)新人才應用技術研究與開發(fā)(青年后備人才)項目(No.2016RQQXJ125)；黑龍江省博士后資助課題(No.LBH-Z16193)

方芳(1980-)，女，助理研究員，博士，博士后，主要從事中醫(yī)藥研究工作。

*通訊作者：田明(1963-)，男，教授，主要研究方向：中藥質量標準研究。