陳 娟 徐 莉 謝冠群 周 佳 謝志軍 甘 靜 范永升

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州，310053)

基于iTRAQ技術(shù)的中醫(yī)實(shí)熱“上火”血清蛋白質(zhì)組學(xué)特征分析

陳 娟 徐 莉 謝冠群 周 佳 謝志軍 甘 靜 范永升

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州，310053)

目的：篩選實(shí)熱“上火”血清差異表達(dá)蛋白，為實(shí)熱“上火”機(jī)制的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)對(duì)血清蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合生物信息學(xué)分析(GO、STRING)篩選實(shí)熱“上火”與正常非“上火”人群差異顯著的蛋白質(zhì)。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，實(shí)熱上火組血清篩選出49個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中上調(diào)的22個(gè)，下調(diào)的27個(gè)。載脂蛋白C3(Apo C3)、乳酸脫氫酶(LDH)和維生素K依賴蛋白S(PROS1)等顯著上調(diào)，而載脂蛋白A4(Apo A4)、超氧化物歧化酶3(SOD3)和纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)等顯著下調(diào)。結(jié)論：觀察組脂質(zhì)代謝、糖酵解異常與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，且凝血功能下降，易造成出血，篩選的差異蛋白可為實(shí)熱“上火”的生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

實(shí)熱上火；iTRAQ；血清蛋白質(zhì)組學(xué)；生物標(biāo)志物

“上火”是對(duì)身體出現(xiàn)口瘡、鼻衄、牙宣、目赤、咽痛、口干便秘等癥狀的統(tǒng)稱，發(fā)生率較高，且與口腔潰瘍、失眠癥等多種常見病的發(fā)病密切相關(guān)[1]。《素問·陰陽應(yīng)象大論》“壯火食氣”“少火生氣”，論述了火的不同作用；火為熱之極、熱為火之漸，火熱同類，常連在一起?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗凡C(jī)十九條，其中9條涉及“火、熱”病機(jī)，強(qiáng)調(diào)了火熱致病的重要性。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)“上火”還沒有統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，認(rèn)為“上火”與機(jī)體免疫功能失調(diào)情況下出現(xiàn)的局部感染、應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)環(huán)境失衡及能量代謝等相關(guān)，醫(yī)學(xué)上也稱之為應(yīng)激性疾病[2-3]。隨著社會(huì)的發(fā)展和亞健康觀念的提出，人們的健康意識(shí)不斷提高，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)上火尚缺乏有效的治療方法，而中醫(yī)學(xué)分別采用清熱瀉火法、滋陰降火法等治療，療效較為明顯，但是中醫(yī)注重宏觀觀察，缺乏對(duì)“上火”科學(xué)內(nèi)涵的認(rèn)識(shí)。因此，運(yùn)用現(xiàn)代的科學(xué)技術(shù)方法來研究“上火”發(fā)生機(jī)制，不僅能夠豐富其科學(xué)內(nèi)涵，同時(shí)對(duì)于防治“上火”和提高人們的健康水平也有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

生命活動(dòng)的功能執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，絕大多數(shù)生命調(diào)控過程、各種代謝過程、疾病的原發(fā)過程以及大多數(shù)藥物作用靶標(biāo)均發(fā)生在蛋白質(zhì)水平。現(xiàn)階段，血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究越來越受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，血清中含有的蛋白質(zhì)種類很多，只有不斷進(jìn)行篩選和鑒定，才能進(jìn)一步幫助探明疾病的發(fā)生、監(jiān)控疾病的進(jìn)程和每個(gè)階段相應(yīng)蛋白表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性及規(guī)律性[4]。相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)自開展以來，在疾病研究和藥物監(jiān)測(cè)方面應(yīng)用廣泛，其不但可以檢測(cè)出更多的低豐度蛋白，甚至可以靈敏的檢測(cè)到其他技術(shù)無法檢測(cè)到的跨膜蛋白，具有高靈敏度、高分辨率、標(biāo)記效率高、樣品兼容性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中被廣泛應(yīng)用[5-6]。

本研究以在校大學(xué)生為研究對(duì)象，基于iTRAQ技術(shù)對(duì)實(shí)熱“上火”和健康人群血清中蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合生物信息學(xué)方法挖掘觀察組與正常非“上火”人群的差異蛋白，尋找其物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的分子標(biāo)志物，為“上火”機(jī)理的深入研究提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年3月至2014年10月浙江中醫(yī)藥大學(xué)在校大學(xué)生43例，分為觀察組(實(shí)熱“上火”人群)和對(duì)照組(正常非“上火”人群)，其中觀察組21例，對(duì)照組22例,其中的一般資料如圖1[7]所示，年齡及性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。促凝管采集血液樣本，30 min內(nèi)以3 000 r/min離心，分離血清后于-80 ℃保存。

圖1 實(shí)熱上火組與正常對(duì)照組的年齡和性別比較

注：control:正常對(duì)照組，SH：實(shí)熱上火組，(a)實(shí)熱上火組與正常對(duì)照組的年齡比較，(b)實(shí)熱上火組與正常對(duì)照組的性別比較。與正常對(duì)照組比較，*P>0.05

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 采用專家咨詢法，通過多輪的專家咨詢，確定的“上火”的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1個(gè)主癥(頭面部癥狀)或2個(gè)次癥(至少1個(gè)為頭面部癥狀)。其中“上火”頭面部主癥：牙齦腫痛、咽喉腫痛、口臭、口腔潰瘍、鼻瘡癤、熱瘡(顏面部皰疹)、口苦、目赤干澀；“上火”頭面部次癥：口角糜爛、目眵增多、舌痛、口渴、鼻衄、鼻腔干燥、齒衄、痤瘡、聲音嘶啞、頭痛；非頭面部癥狀：大便干結(jié)、心煩、小便黃、多食易饑、五心煩熱、痔瘡發(fā)作、潮熱、失眠[7]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)熱“上火”的納入標(biāo)準(zhǔn)為：1)1個(gè)主癥+舌象或脈象，其中主證為：眼眵或痰或涕等分泌物增多、黃稠，發(fā)熱或惡熱、目赤、面紅、牙齦腫痛、大便秘結(jié)；舌脈為舌紅苔黃燥、脈數(shù)有力[7]。2)平和質(zhì)健康人群(作為正常對(duì)照組)，符合《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》[8]中平和質(zhì)的判定標(biāo)準(zhǔn)；3)年齡18～60周歲；4)自愿參加本實(shí)驗(yàn)研究并同意簽署臨床研究知情同意書者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；2)合并精神病、腫瘤、自身免疫性疾病以及系統(tǒng)靶器官嚴(yán)重病變等疾病的患者；3)妊娠及哺乳期的婦女；4)研究中認(rèn)為有任何不適宜入選的情況[7]。

1.5 試劑與儀器 iTRAQ試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA，USA)，胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO，USA)。Agilent MARS-14柱(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)，旋轉(zhuǎn)真空濃縮器RVC 2-25，Christ，Osterode，Germany)，旋轉(zhuǎn)真空濃縮器(RVC 2-25，Christ，Osterode，Germany)，聚乙烯基柱(2.1×100 mm，5 μm，200 μm;Nest Group，Inc.，Southborough，MA，USA)，ZORBAX 300SB-C18柱(5 μm，200?，0.1×150 mm，Microm，Auburn，CA，USA)，Triple TOF 5600系統(tǒng)(Applied Biosystems)。

1.6 方法

1.6.1 酶解與iTRAQ標(biāo)記 將每組樣本的血清混合，根據(jù)iTRAQ試劑盒說明書對(duì)各組血清樣品進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記。為了富集低豐度蛋白，使用Agilent MARS-14柱去除14種高豐度蛋白，包括白蛋白，IgG和觸珠蛋白等，然后蛋白質(zhì)被濃縮和脫鹽，通過Bradford方法定量蛋白質(zhì)樣品的洗脫液。將每組的蛋白質(zhì)樣品(100 μg)還原，烷基化，并用胰蛋白酶在37 ℃下消化過夜。正常對(duì)照組和實(shí)熱上火組分別應(yīng)用115和118試劑標(biāo)記。

1.6.2 MS/MS鑒定與數(shù)據(jù)分析 iTRAQ試劑將2個(gè)樣品組混合，脫鹽和干燥。通過強(qiáng)陽離子交換(SCX)液相色譜法使用聚乙烯基柱將iTRAQ-標(biāo)記的肽分段?？偣彩占?0個(gè)SCX組分，濃縮并溶解。隨后加載樣品到ZORBAX 300SB-C18柱。組件進(jìn)行SCX色譜法到MS分析2次。峰面積的比率的iTRAQ報(bào)告離子反映了相對(duì)豐富的肽和蛋白質(zhì)。蛋白使用ProteinPilotTM軟件(Applied Biosystems，Version 4.2)進(jìn)行鑒定和定量，使用ProGroup算法識(shí)別肽，MS/MS數(shù)據(jù)通過人類國(guó)際蛋白指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)(HIPI，version 3.87)搜索[9-10]。統(tǒng)計(jì)分析以組間表達(dá)差異>1.5(上調(diào))或<0.5(下調(diào))，且以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，篩選差異蛋白質(zhì)。

圖2 數(shù)據(jù)采集的實(shí)熱“上火”血清蛋白生物標(biāo)志物分析

注：(A)生物過程;(B)細(xì)胞成分;(C)分子功能;(D)COG功能分類;(E)通過String軟件分析的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)作用圖

1.6.3 生物信息學(xué)分析 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞組分，分子功能和生物學(xué)過程通過Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，相互作用網(wǎng)絡(luò)通過STRING軟件分析(http://string-db.org/)分析，相互作用可信度為0.9(可信度最大值為1)，并且將鑒定到的蛋白質(zhì)和COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins蛋白相鄰類的聚簇)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 血清蛋白質(zhì)組鑒定分析結(jié)果 使用iTRAQ-2D LC-MS/MS篩選對(duì)照組與實(shí)熱“上火”組差異蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，2次鑒定結(jié)果中共有蛋白質(zhì)取2次鑒定的平均值，分別鑒定的以當(dāng)次結(jié)果為準(zhǔn)。使用R程序包TopGO，選取P<0.05的富集結(jié)果，使用string database進(jìn)行分析，相互作用可信度為0.9。

2.2 觀察組與對(duì)照組血清差異表達(dá)蛋白 進(jìn)一步篩選到觀察組與對(duì)照組間49個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括22個(gè)表達(dá)上調(diào)蛋白(>2.0倍，P<0.05)(表1)和27個(gè)下調(diào)蛋白(<0.5倍，P<0.05)(表2)。見表1-2。GO富集分析差異化表達(dá)的蛋白質(zhì)主要參與單一生物過程(10.17%)、刺激應(yīng)答(9.18%)和生物調(diào)節(jié)(8.44%)(圖2A)此外，蛋白質(zhì)集中定位于細(xì)胞(15.42，15.42%)和細(xì)胞器(12.08%)(圖2B)，多數(shù)具有結(jié)合(51.19%)、催化活性(17.86%)酶調(diào)節(jié)活性(11.90%)(圖2C)。該COG功能分類圖顯示：蛋白質(zhì)功能主要集中在次生代謝產(chǎn)物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解代謝(7個(gè)蛋白質(zhì))(圖2D)。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖集中指向纖溶-凝血-補(bǔ)體系統(tǒng)，以及脂質(zhì)代謝異常(圖2E)。

2.3 血清差異蛋白篩選與鑒定 觀察組與對(duì)照組存在顯著差異的49個(gè)蛋白質(zhì)中，經(jīng)過篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)和“上火”病證相關(guān)的主要差異蛋白有載脂蛋白(ApoC3、ApoA4)、補(bǔ)體蛋白(C4A，C4BPA)、炎性因子(SAA1、CRP)、凝血功能相關(guān)因子類(PROS1、A1AT、PAI-1)、糖酵解相關(guān)酶LDH及抗氧化蛋白酶SOD3等。

3 討論

表1 實(shí)熱“上火”與正常人群相比顯著上調(diào)的差異蛋白質(zhì)(22個(gè))

表2 實(shí)熱“上火”與正常人群相比顯著下調(diào)的差異蛋白質(zhì)(27個(gè))

載脂蛋白是一類家族較龐大的蛋白，包括A、B、C、E族等，脂質(zhì)必須和載脂蛋白結(jié)合才能正常轉(zhuǎn)運(yùn)，與脂質(zhì)代謝的平衡息息相關(guān)。載脂蛋白(Apo)C3和A4基因，它們是ApoA1/C3/A4/A5基因簇的成員，在脂質(zhì)代謝中起重要作用，其多態(tài)性變異可導(dǎo)致高脂血癥，是心血管疾病的易感因素。ApoC3是有效抑制VLDL-TG水解作用的重要因子，濃度升高見于代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化等，是形成心血管疾病的危險(xiǎn)因子。ApoC3也能激活NF-κB和單核細(xì)胞，促進(jìn)各種炎性反應(yīng)和導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。ApoA4參與乳糜微粒合成和分泌，并參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，是高密度脂蛋白(HDL)和乳糜微粒(CM)的主要成分，具有抗炎和抗動(dòng)脈硬化的屬性，是一種重要的“內(nèi)源性”抗氧化劑[11]。C反應(yīng)蛋白(CRP)是機(jī)體在理化因素、腫瘤、外傷、感染等刺激下由肝臟合成而產(chǎn)生的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，可反映疾病嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)歸情況，感染或非感染性炎性反應(yīng)時(shí)血清CRP明顯升高，因此常常作為診斷感染的生物學(xué)指標(biāo)[12]。綜上所述，結(jié)果顯示觀察組CRP和ApoC3顯著上調(diào)，ApoA4顯著下調(diào)，說明觀察組的脂質(zhì)代謝異常，抗炎、抗氧化能力降低與炎性反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。

超氧化物歧化酶(SOD)在機(jī)體中作為重要的防御體系，能消除新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其有3種亞型：胞質(zhì)內(nèi)的SOD1、線粒體內(nèi)SOD2及細(xì)胞外Cu/Zn-SOD(SOD3)[13]。Cu/Zn-SOD因其重要的生理功能和巨大的治療潛能，被認(rèn)為是超氧化物歧化酶家族最重要的一類酶。研究表明Cu/Zn-SOD具有抗血管生成和抗炎作用，可通過阻止免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和抑制白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏著參與免疫應(yīng)答，其不僅可作為一種抗氧化劑，而且還能作為信號(hào)傳播的一個(gè)控制器，參與信號(hào)傳導(dǎo)。目前通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因越來越多的研究結(jié)果揭示，SOD3與衰老、高血壓、糖尿病、細(xì)胞凋亡與增生等相關(guān)[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組SOD3表達(dá)顯著降低，推測(cè)實(shí)熱“上火”引起的炎性反應(yīng)、抗氧化能力降低等癥狀與SOD3的變化密切相關(guān)。觀察組多發(fā)生局部炎性反應(yīng)，如口腔潰瘍、牙齦炎等，本課題代謝組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者血中乳酸出現(xiàn)上調(diào)，推測(cè)炎性反應(yīng)部位物質(zhì)分解代謝加快，組織耗氧量增加，局部出現(xiàn)微循環(huán)障礙，影響氧供應(yīng)，引發(fā)無氧糖酵解增強(qiáng)，釋放的乳酸未能及時(shí)被清除，在血液中堆積[7]。乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，廣泛存在于機(jī)體各種組織中，其中以心肌、骨骼肌和腎臟含量最為豐富，當(dāng)組織細(xì)胞受到炎性反應(yīng)等損傷時(shí)會(huì)釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致血中含量明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)LDH表達(dá)顯著升高，結(jié)合同批次人群代謝組學(xué)結(jié)果乳酸含量的升高，證實(shí)實(shí)熱“上火”情況下糖酵解增強(qiáng)。

此外，研究觀察組炎性反應(yīng)及免疫相關(guān)差異蛋白均存在于凝血與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路，是內(nèi)源性凝血激活途徑和經(jīng)典補(bǔ)體激活途徑的重要調(diào)節(jié)蛋白。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中蛋白并不是孤立存在的，眾多的蛋白在同一條生化反應(yīng)途徑中執(zhí)行各自的生理功能，不同的蛋白信號(hào)通路通過媒介又相互聯(lián)系，在凝血與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路中，補(bǔ)體C4具有中和病毒的生物學(xué)活性，可水解為C4A、C4B，它們?cè)谘a(bǔ)體活化、促進(jìn)吞噬、防止免疫復(fù)合物沉著和中和病毒等方面發(fā)揮作用。補(bǔ)體C4BP是一種可溶性血漿糖蛋白，是補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑中一個(gè)重要調(diào)節(jié)蛋白[17]。維生素K依賴蛋白S(PROS1)是參與補(bǔ)體活化過程調(diào)控的一種血漿蛋白質(zhì)，PROS1能與C4BP結(jié)合，參與補(bǔ)體活化，補(bǔ)體的過度(異常)活化可以引起炎性反應(yīng)及組織損傷。同時(shí)PROS1也是一種抗凝血因子，可以作為輔因子激活蛋白C，抑制血液凝固[18]。SERPINA1基因編碼的蛋白α1-抗胰蛋白酶(A1AT)的升高能夠抑制凝血酶活性，抑制血纖維蛋白凝血酶原的生成，從而抑制纖維蛋白凝塊降解[17]。SERPINE1基因編碼的蛋白纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)是纖溶酶原激活劑tPA和uPA的主要抑制劑，是纖溶系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，PAI-1不僅在纖溶過程和在維持凝血和纖溶的動(dòng)態(tài)平衡中有作用，在體內(nèi)許多的生理過程中都有作用，例如能抑制蛋白的降解，如凝血、結(jié)締組織演變、補(bǔ)體激活、炎性反應(yīng)過度反應(yīng)等[19-20]。PAI-1表達(dá)降低可引起纖溶(酶)活性異常增強(qiáng)，影響凝血功能，造成出血，說明觀察組的凝血功能下降。

綜上所述，觀察組的癥狀可能通過纖溶-凝血-補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路引起，該信號(hào)通路上的差異蛋白可作為“上火”生物學(xué)基礎(chǔ)研究的潛在靶點(diǎn)。另外該信號(hào)通路間接激活炎性反應(yīng)，載脂蛋白、SOD3的變化引起抗氧化能力降低可能是實(shí)熱“上火”表征的另一路徑或靶向治療的關(guān)注點(diǎn)。

[1]馬捷,宋月晗,梁嶸,等.“上火”科學(xué)內(nèi)涵的文獻(xiàn)研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2016,31(3):372-375.

[2]李思敏,包潔，梅麗君,等.論“上火”與飲食[J].黑龍江中醫(yī)藥,2015，44(2):6-7.

[3]唐曉陽,謝冠群,范永升.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)上火的認(rèn)識(shí)及其對(duì)中醫(yī)治療的啟示[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2013,15(3):389-390.

[4]Gianazza E,Miller I，Palazzolo L,et al.With or without you-Proteomics with or without major plasma/serum proteins[J].J Proteomics，2016(140):62-80.

[5]王秋紅,王悅,楊欣,等.基于iTRAQ技術(shù)的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2017，1(1):5-7.

[6]Anderson NL，Matheson AD，Steiner S.Proteomics：applications in basic and applied biology[J].Curr Opin Biotechnol,2000,11(4):408-412.

[7]周佳,吳德鴻,韋雙雙,等.基于GC-MS對(duì)中醫(yī)實(shí)熱“上火”血清代謝特征的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2017，32(4):1789-1792.

[8]中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì).中醫(yī)體質(zhì)分類與判定[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2009.

[9]Wang YS，Cao R，Jin H，et al.Altered protein expression in serum from endometrial hyperplasia and carcinoma patients[J].J Hematol Oncol,2011,4(1)：15.

[10]Jin GZ,Li Y,Cong WM,et al.iTRAQ-2DLC-ESI-MS/MS based identification of a new set of immunohistochemical biomarkers for classification of dysplastic nodules and small hepatocellular carcinoma[J].J Proteome Res,2011,10(8)：3418-3428.

[11]Kang SH,Kim YR,Hong SH.Synergic effects of the ApoC3 and ApoA4 polymorphisms on the risk of hypertension[J].Genes & Genom，Genes & Genomics,2017(39)：1-10.

[12]Wu JJ，Rowan CG，Bebchuk JD，et al.Association between tumor necrosis factor inhibitor(TNFi)therapy and changes in C-reactive protein(CRP)，blood pressure，and alanine aminotransferase(ALT)among patients with psoriasis，psoriatic arthritis，orrheumatoid arthritis[J].J Am Acad Dermatol，2015,72(5)：917-919.

[13]Batinic-Haberle I，Tovmasyan A，Roberts ER，et al.SOD therapeutics：latest insights into their structure-activity relationships and impact on the cellular redox-based signaling pathways[J].Antioxid Redox Signal,2014，20(15):2372-2415.

[14]Jiang W，Tang L，Zeng J，et al.Adeno-associated virus mediated SOD gene therapy protects the retinal ganglion cells from chronic intraocular pressure elevation induced injury via attenuating oxidative stress and improving mitochondrial dysfunction in a rat model[J].Am J Transl Res，2016，8(2):799-810.

[15]Doddigarla Z,Parwez I,Ahmad J.Correlation of serum chromium，zinc，magnesium and SOD levels with HbA1c in type 2 diabetes：A cross sectional analysis[J].Diabetes Metab Syndr，2016,10(1 Suppl 1):S126-S129.

[16]Wei LF，Zhang HM，Wang SS，et al.Changes of MDA and SOD in brain tissue after secondary brain injury with seawater immersionin rats[J].Turk Neurosurg，2016，26(3)：384-388.

[17]張海燕,張淼,呂順武,等.凝血與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路對(duì)艾滋病濕熱內(nèi)蘊(yùn)證發(fā)病的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2017,20(6):694-698.

[18]Rodriguez-Leal GA,Morn S,Corona-Cedillo R,et al.Portal vein thrombosis with protein C-S deficiency in a non-cirrhotic patient[J].World J Hepatol,2014,6(7):532-537.

[19]Agirbasli M,Eren M,Yasar S,et al.Functionally stable plasminogen activator inhibitor-1 in a family with cardiovascular disease and vitiligo[J].Journal of thrombosis and thrombolysis,2014,38(1):50-56.

[20]Sahebkar A,Simental-Mendia LE,Watts GF,et al.Impact of fibrate therapy on plasma plasminogen activator inhibitor-1：a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Atherosclerosis 2015，240(1):284-296.

AnalysisofSerumProteomicsFeaturesof“Shanghuo”inTraditionalChineseMedicineBasedoniTRAQTechnology

Chen Juan, Xu Li, Xie Guanqun, Zhou Jia, Xie Zhijun, Gan Jing, Fan Yongsheng

(CollegeofBasicMedicalSciences,ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310053,China)

Objective:To screen differentially expressed proteins in excessive heat “shanghuo” serum and provide a scientific basis for in-depth study on the mechanism of excessive heat “shanghuo”.MethodsSerum proteins were detected by relative and absolute quantitative isotope labeling (iTRAQ), and bioinformatics analysis (GO, STRING) was used to screen the proteins that were significantly different between the normal fever group and normal non-lit group subjects.ResultsCompared with the normal control group, 49 differentially expressed proteins were screened by excessive heat “Shanghuo” group, with 22 up-regulated and 27 down-regulated. Apolipoprotein C3 (Apo C3), lactate dehydrogenase (LDH), and vitamin K-dependent protein S (PROS1) were significantly up-regulated while Apo A4, SOD3 and the plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) and so on were significantly down-regulated.ConclusionThe abnormal lipid metabolism and glycolytic abnormality in the “shanghuo” crowd are closely related to the occurrence of oxidative stress and inflammation, and the coagulation function is decreased, leading to easily bleeding. The differential proteins screened can provide references for biological foundation of basic research on “shanghuo”.

Excessive heat; iTRAQ; Serum proteomics; Biomarker

R22;R24

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.008

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2014CB543001)；973計(jì)劃子課題(2014CB543001-1)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(JCIT2016-1)

陳娟(1984.09—)，女，博士，副教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治疑難病，E-mail：mytw_00@163.com

范永升(1955.11—)，男，博士，教授，國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科帶頭人，研究方向：中醫(yī)藥防治風(fēng)濕自身免疫病，E-mail:fyszjtcm@163.com

(2017-11-03收稿 責(zé)任編輯：張文婷)