， ，

(1. 濟南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 山東 濟南 250022; 2. 濟南大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 山東 濟南 250002)

海洋貝類腸道弧菌21Z1堿性蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

胡志恒1,2，李玉梅1，李強1

(1.濟南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東濟南250022; 2.濟南大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,山東濟南250002)

由威海海域貝類腸道中分離出一株產(chǎn)胞外堿性蛋白酶的細菌，經(jīng)16S rDNA分析鑒定為弧菌21Z1。該菌發(fā)酵液上清經(jīng)60%飽和度的硫酸銨溶液沉淀、透析、Sephadex-G100分子篩層析等步驟，獲得電泳純的21Z1堿性蛋白酶，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示其分子量約為31 kDa。酶學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果顯示：該酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在20～40 ℃穩(wěn)定；最適反應(yīng)pH為8.5，在pH=8.5～11.0間穩(wěn)定；Na+、K+、Ca2+、Mn2+對該酶具有激活作用，F(xiàn)e2+、Fe3+、Zn2+及Cu2+則不同程度地抑制其活性；該酶的耐鹽性檢測結(jié)果顯示，在Na+濃度為4 mol/L時， 殘余酶活在62%以上，表明21Z1堿性蛋白酶具有較強的耐鹽性。

弧菌；堿性蛋白酶；純化；酶學(xué)性質(zhì)；耐鹽性

堿性蛋白酶(alkaien protease)是指在堿性環(huán)境下具有較高酶活力和穩(wěn)定性的酶，用于水解蛋白質(zhì)或多肽[1]，其適宜pH在8.0～11.0，廣泛存在于動、植物及微生物中。微生物堿性蛋白酶大多為胞外酶，具有成本低、容易制備、適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢，備受研究者關(guān)注。堿性蛋白酶廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中可用于飼料中蛋白質(zhì)分子的分解[2]； 在皮革業(yè)中，堿性蛋白酶可用于脫毛，同時可減小物理、化學(xué)處理對皮革的損害，減少環(huán)境污染[3-4]。此外，堿性蛋白酶在食品、洗滌劑、醫(yī)藥等行業(yè)也具有非常重要的作用。

近年來，海洋微生物堿性蛋白酶引起了人們的極大關(guān)注[5-9],國內(nèi)外研究者相繼開發(fā)出多種新型海洋微生物蛋白酶。由于海洋環(huán)境條件特殊，海洋微生物具有多樣性[10]，因此研究發(fā)現(xiàn)海洋微生物所產(chǎn)堿性蛋白酶也具有一定的獨特性與復(fù)雜性[11]。已報道的海洋微生物堿性蛋白酶耐鹽性并不好，限制了該酶在高鹽度加工行業(yè)中的應(yīng)用，如咸味動植物蛋白風(fēng)味食品加工，因此，開發(fā)可用于食品加工的耐鹽蛋白酶非常必要。本文中從威海海域可食性貝類腸道中分離出一株產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株21Z1，對該菌株進行了初步鑒定，分離純化了21Z1堿性蛋白酶，并測定了其酶學(xué)性質(zhì)，為進一步開發(fā)該酶的商業(yè)應(yīng)用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

海洋細菌Vibriosp.21Z1，分離自威海海域，由濟南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院特殊生境微生物實驗室篩選及保藏。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蔗糖的質(zhì)量濃度為10 g/L，胰蛋白胨的質(zhì)量濃度為5 g/L，酵母提取物的質(zhì)量濃度為1 g/L， 磷酸氫二鉀(K2HPO4)的質(zhì)量濃度為3 g/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4)的質(zhì)量濃度為1 g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)的質(zhì)量濃度為0.5 g/L，人工海水配制，pH=7.5。

人工海水： 33 g人工海鹽用去離子水定容至1 L，室溫放置3～5 d后使用。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

16S rDNA多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增通用引物為 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′和1492R：5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min，54 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸5 min。擴增PCR產(chǎn)物送往上海生物工程有限公司進行測序。利用MEGA4.1軟件鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 粗酶液制備

將菌株21Z1按質(zhì)量分數(shù)1%接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基， 轉(zhuǎn)速180 r/min離心分離， 溫度28 ℃， 培養(yǎng)48 h。 發(fā)酵液于4 ℃、 12 000 r/min離心分離20 min， 上清液即為粗酶液。

1.2.3 酶活力測定

根據(jù)Folin-酚試劑法[12]測定酶活力。 取1 mL酶液， 40 ℃水浴預(yù)熱3 min， 再加入5 mL質(zhì)量分數(shù)2%酪氨酸溶液， 混勻， 放入40 ℃水浴20 min， 加入1 mL濃度為0.4 mol/L的三氯乙酸溶液，轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心分離5 min， 取1 mL上清液，加入5 mL濃度為0.4 mol/L的碳酸鈉溶液，再加入1 mL福林試劑， 40 ℃水浴顯色20 min。對照組先加三氯乙酸溶液，再加入酪氨酸溶液，其他步驟相同。測定波長為660 nm的吸光度值λ660，以每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位。

1.2.4 硫酸銨沉淀、透析

將粗酶液分別按質(zhì)量分數(shù)為40%、 50%、 60%、 70%、 80%的飽和硫酸銨溶液的濃度，緩慢加入已稱好的硫酸銨粉末，磁力攪拌至全部溶解，4 ℃過夜。轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心分離20 min， 分別檢測沉淀和上清的酶活，確定蛋白酶沉淀的最適硫酸銨濃度。用最適濃度的硫酸銨進行沉淀，將沉淀溶于濃度為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)，透析過夜，每4 h更換一次透析液，透析后將酶液冷凍干燥。

1.2.5 分子篩層析以及聚丙烯酰胺凝膠電泳

冷凍干燥后的樣品溶解于濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，并利用Sephadex G-100(1.5 cm×100 cm)進行分子篩凝膠層析，樣品總蛋白質(zhì)量濃度為1 g/L，洗脫液濃度為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH=7.5)，流速為0.5 mL/min，收集洗脫液并測定酶活力，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測其純度。

1.3 酶學(xué)性質(zhì)的測定

1.3.1 酪氨酸底物濃度對酶活力的影響

將酪氨酸底物用濃度為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)配制成質(zhì)量濃度分別為5、 10、 15、 20、 25、 30、 40、 50 g/L的蛋白溶液， 然后根據(jù)國際Folin-酚試劑法[12]測定不同底物濃度下的酶活力大小。

1.3.2 溫度對酶活性和穩(wěn)定性的影響

將酶液分別在20、 30、 40、 50、 60、 70、 80 ℃的反應(yīng)溫度下進行酶活性測定， 檢測不同溫度對酶活性大小的影響； 將酶液分別在以上溫度下預(yù)熱30 min后， 在40 ℃的反應(yīng)溫度條件下測定酶活性， 檢測溫度穩(wěn)定性對酶活力的影響。

1.3.3 pH對酶活力和穩(wěn)定性的影響

將酶液在不同pH的酪蛋白溶液中測定酶活力，不同pH的緩沖液為：濃度為0.2 mol/L磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液(pH=6.0～7.5)；濃度為0.2 mol/L Tris-鹽酸緩沖液(pH=8.0～8.5)；濃度為0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH=9.0～10.0)； 濃度為0.2 mol/L磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH=11.0～13.0)。用以上不同pH的緩沖液稀釋酶液，放置6 h后，在40 ℃條件下進行測定酶活力。

1.3.4 Na+濃度對酶活力的影響

分別配制濃度為0.04、0.4、2、4、6、8、10 mol/L的NaCl溶液，每100 μL酶液中分別加入100 μL上述濃度的Na+溶液，其他測定酶活性的條件不變，分別測定不同Na+濃度對酶活力的影響。

1.3.5 金屬離子以及SDS對酶活力的影響

選取Na+、K+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+共9種離子化合物，配成濃度為1 mol/L的溶液，與酶液等體積混合，以不加金屬離子的酶液作為空白對照，測定不同金屬離子對酶活力影響；分別配制質(zhì)量分數(shù)為0.5%、1%的SDS溶液，等體積與酶液混合，并以不加SDS的酶液作為空白對照，測定相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株21Z1 16S rDNA測序以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株21Z1 經(jīng)測定后的16S rDNA基因序列已經(jīng)在GenBank中登錄，其登錄號為KT963026。利用BLAST軟件在NCBI網(wǎng)站上進行序列比對分析，結(jié)果表明，菌株21Z1與海洋弧菌Vibriosp.的同源相似性達到97%。利用MEGA4.1軟件鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示?？梢钥闯?，菌株21Z1與弧菌屬為同一分支，在系統(tǒng)進化中親緣關(guān)系最相近，因此，初步鑒定海洋菌21Z1為海洋弧菌屬(Vibriosp.)。

圖1 菌株21Z1及其相關(guān)菌株的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 硫酸銨沉淀

硫酸銨沉淀后沉淀與上清液的酶活力如圖2所示。由圖可以看出：粗酶液經(jīng)過硫酸銨沉淀后， 蛋白酶大多都已經(jīng)被沉淀下來， 上清液只含有少量的酶； 而且， 通過比較粗酶液在質(zhì)量分數(shù)為40%、 50%、 60%、 70%、 80%的飽和硫酸銨溶液中的酶活力， 發(fā)現(xiàn)硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為60%的飽和溶液中沉淀蛋白酶效果最好，因此粗酶液選用硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為60%的飽和溶液進行沉淀。

圖2 硫酸銨沉淀后沉淀與上清液的酶活力

2.3 分子篩層析和SDS-PAGE電泳檢測

樣品經(jīng)Sephadex G-100 Fast Flow層析，59號管收集液蛋白酶活性最高。利用SDS-PAGE檢測其純度， 結(jié)果如圖3所示， 其中的蛋白酶只有1條帶，其分子量約為31 kDa。

2.4 菌株21Z1蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 底物濃度對酶活力的影響

通過酪氨酸底物濃度影響實驗得知， 該酶在酪氨酸底物質(zhì)量濃度為20 g/L時， 酶活力最大， 在20 g/L范圍內(nèi)， 酶活力隨著底物質(zhì)量濃度的增加而增加；在超過20 g/L后，酶活力隨著底物質(zhì)量濃度增加而減少并趨于平衡(圖4)，因此，該酶的最適底物質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖

圖4 酪氨酸底物質(zhì)量濃度對酶活力的影響

2.4.2 溫度對酶活力的影響

蛋白酶受溫度影響及其穩(wěn)定性曲線如圖5所示。 由圖5(a)可以看出： 該酶在反應(yīng)溫度為 40 ℃時， 相對酶活力值最大； 在20～50 ℃時有較高的活性， 相對酶活力值在36.5%以上； 在50～80 ℃時內(nèi)， 活性隨著溫度的升高而減小， 在80 ℃時的相對酶活力值只達到7.63%。 圖5(b)可以看出， 該酶穩(wěn)定性隨著溫度的升高而下降， 在20～40 ℃時穩(wěn)定性較好， 其殘余酶活力值可達到60%以上， 而在50 ℃以上， 殘余酶活力值減小到20%以下。 綜上可以看出， 菌株21Z1產(chǎn)生的蛋白酶最適宜反應(yīng)溫度為40 ℃。

2.4.3 pH對酶活力的影響

蛋白酶受pH影響及其穩(wěn)定性曲線如圖6所示。由圖6(a)可看出，該酶在不同pH緩沖液體系中，酶活性波動較大，最適宜pH為8.5，且在pH為8.0～10.0時，相對酶活力值較大，在pH為12.0時依然有60%以上的酶活力，說明菌株21Z1產(chǎn)生的蛋白酶為堿性蛋白酶。如圖6(b)所示，該酶在不同pH緩沖液放置6 h后，在pH為8.5～11.0時仍可保持較好的穩(wěn)定性，殘余酶活力值在80%以上，這些數(shù)據(jù)進一步證明該酶為堿性蛋白酶[13]。

(a)溫度

(b)溫度穩(wěn)定性圖5 蛋白酶受溫度影響及其穩(wěn)定性曲線

(a)pH

(b)pH穩(wěn)定性圖6 蛋白酶受pH影響及其穩(wěn)定性曲線

2.4.4 Na+濃度對酶活力的影響

NaCl濃度對酶活力的影響如圖7所示。由圖可以看出，Na+濃度在0.02～0.2 mol/L時，該酶活性隨Na+濃度的升高而增大；在濃度為0.2～4 mol/L時， 酶活性緩慢降低，在Na+濃度為4 mol/L時， 其殘余相對酶活力值大于60%，這說明21Z1堿性蛋白酶具有較強的耐鹽性，這一性質(zhì)在相關(guān)文獻中未見報道。

圖7 NaCl濃度對酶活力的影響

2.4.5 金屬離子以及SDS對酶活力的影響

經(jīng)實驗驗證，Na+、K+、Ca2+、Mn2+等金屬離子對21Z1蛋白酶具有激活作用，其中Mn2+激活作用最強；Fe2+、Fe3+、Zn2+對該酶有不同程度的抑制作用，其中Cu2+強烈抑制酶活性；不同濃度SDS對該酶有一定的抑制作用，在低濃度下該酶還能保持較高的酶活力，而SDS濃度的升高對酶活力的抑制作用也逐漸增強。

3 結(jié)論

從威海海域貝類腸道中分離出一株產(chǎn)堿性蛋酶的菌株21Z1， 經(jīng)其16S rDNA序列分析鑒定為弧菌(Vibriosp.)， 且已經(jīng)在GenBank中登錄， 其登錄號為KT963026。 菌株21Z1分泌的堿性蛋白酶， 經(jīng)硫酸銨沉淀、 透析、 分子篩層析等步驟， 獲得電泳純， 其分子量在31 kDa左右。 酶學(xué)性質(zhì)檢測顯示： 該酶最適宜反應(yīng)溫度為40 ℃， 最適宜pH為8.5， 在pH為8.5～11.0時可保持較好的穩(wěn)定性，相對酶活力值在80%以上， 屬于堿性蛋白酶的范疇； Na+、K+、Ca2+、 Mn2+等金屬離子對該酶起到激活作用， 以Mn2+的激活作用最為顯著； Fe2+、 Fe3+、 Zn2+對該酶有不同程度的抑制作用， 而Cu2+強烈抑制該酶活性， 可能是抑制了該酶的活性中心位點； SDS對該酶也有抑制作用， 且SDS濃度越高， 抑制作用逐漸增強。

21Z1蛋白酶具有很好的耐鹽析性，低濃度的Na+對該酶有一定的激活作用。當(dāng)Na+濃度小于4 mol/L時， 其殘余酶活力值在60%以上。根據(jù)文獻報道，高濃度的鹽離子能夠?qū)е旅耕}析沉淀[14-15]，而21Z1蛋白酶是生長于貝類腸道中，因此在高鹽度下仍可穩(wěn)定存在于溶液中，并保持較高的酶活性，這一強耐鹽性在相關(guān)中文獻中未見報道[16-18]。

綜上所述， 21Z1堿性蛋白酶可解決部分高鹽食品加工過程中蛋白酶失活問題。 在制作魚露等水產(chǎn)品的過程中， 發(fā)酵的同時需要加入蛋白酶進行水解， 形成含有豐富氨基酸以及多肽的調(diào)味品， 且鹽度對產(chǎn)品口味起到關(guān)鍵的影響， 降低鹽度會產(chǎn)生異味[19-20]。 大部分商業(yè)蛋白酶在高鹽度下容易失活， 因此能夠在高鹽的環(huán)境中依然保持較好的酶活力的蛋白酶， 對于食品以及水產(chǎn)品的生產(chǎn)至關(guān)重要。 21Z1堿性蛋白酶因來源于可食性海洋貝類， 可以很好地解決以上風(fēng)味蛋白類食品加工中存在的問題， 同時， 其來源安全環(huán)保， 因而具有較好的應(yīng)用前景。

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PurificationandCharacterizationofAlkakineProteasefromMarineShelfishVibriosp. 21Z1

HUZhiheng1, 2,LIYumei1,LIQiang1

(1.Schoolof Biological Science and Biotechnology, University of Jinan, Jinan 250022, China;2.Shandong Academy of Medical Sciences, University of Jinan, Jinan 250002, China)

A strain was isolated from intestinal of shellfish in Weihai waters which could produce extracellular alkaine protease, and was identified asVibriosp. 21Z1 by 16S rDNA analysis.The purified alkaine enzyme 21Z1 was obtained through ammonium sulfate precipitation, dialysed and Sephadex-G100 column chromatography. Its molecular weight was determined as about 31 kDa by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)analysis. The results show that the optimal temperature of this enzyme is 40 ℃, and it is stable at 20～40 ℃. The optimal pH of this enzyme is 8.5, and it is stable at pH ranging from 8.5～11.0. Na+, K+, Ca2+, and Mn2+have effect on its enzyme activity while Fe2+, Fe3+, Zn2+and Cu2+have various degrees of inhibition effect upon this enzyme. The salt tolerance test of enzyme 21Z1 exhibits the residual protease activity remains more than 62% at 4 mol/L concentration of Na+, so alkaine protease 21Z1 has good salt resistance.

Vibriosp.;alkaline protease; purification; enzymatic characteristics; salt resistance

2016-12-27 < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版時間

時間：2017-12-13 16:49

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室開放課題(BRBY1405)

胡志恒(1991—)，男，山東濟寧人。碩士研究生，研究方向為微生物與生化藥學(xué)。電話:15063375930，E-mail:672312326@qq.com。

李玉梅(1980—)，女，吉林省松原人。 副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向為放線菌次生代謝。E-mail：mls_liym@ujn.edu.cn。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/37.1378.N.20171212.1637.022.html

1671-3559(2018)01-0077-06

10.13349/j.cnki.jdxbn.2018.01.011

TS254

A

(責(zé)任編輯:于海琴)