張素英 李瑞靜 趙晶晶 韓 雷 劉光義 李瑞杰（河北省新樂市中醫(yī)醫(yī)院，河北 新樂 050700）

2型糖尿?。═2DM）是代謝和內(nèi)分泌功能紊亂常見的綜合征，其主要病理學(xué)改變是胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙。糖尿病的發(fā)病率在全球迅速增加，預(yù)計(jì)到2025年將達(dá)到3億人，其中約1/3將發(fā)展為糖尿病腎?。―N）［1-2］，是終末期腎病（ESRD）的主要原因［3］。 至今為止，有關(guān)DN病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此，對于DN的治療，臨床上方法有限。目前，DN的主要治療方法主要是通過抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)降低血糖和血壓水平。然而，這些方法僅僅延緩了DN進(jìn)程，從而延緩ESRD的進(jìn)展，但不能阻止進(jìn)展到ESRD［4-5］。

高血糖刺激后NLRP3炎性體活化后可激活Caspase-1，促使白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）分泌，而 IL-1β水平的增加是2型糖尿病進(jìn)展及胰島素抵抗的重要危險因素［6］，對其活化的抑制可以顯著減弱大鼠的腎組織的炎性反應(yīng)和改善腎功能［7］。因此，在DN發(fā)病及進(jìn)展過程中NLRP3炎性體起著關(guān)鍵作用。研究表明，銀杏葉提取物黃酮酸苷和銀杏內(nèi)酯具有抗氧化應(yīng)激和減弱炎癥反應(yīng)等［8-9］多重功效，有延緩糖尿病腎病的進(jìn)展的治療作用。所以我們以NLRP3炎性體和繼發(fā)的炎性反應(yīng)為研究切入點(diǎn)，來探討銀杏葉提取物可能通過抑制NLRP3炎性體活性來發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，為臨床提供延緩DN發(fā)生發(fā)展的治療理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性Wistar大鼠72只，體質(zhì)量為 200～250 g（6～8 周齡），SPF 級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：（粵）2010-0009。動物飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境的籠子中，12 h明暗循環(huán)，恒溫（25±2）℃，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物與試劑 銀杏葉提取物（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號：Z20027963）；鏈脲佐菌素、5-二苯基四氮唑溴鹽（Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；Caspase-1、IL-1β、白細(xì)胞介素-18（IL-18）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（Cell Signaling Technology公司）。

1.3 造模及分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為對照組、DM組與DM+GBE組各24只。將鏈脲佐菌素溶于0.1 mmol/L，pH為4.5的枸櫞酸緩沖液中，DM組及DM+GBE組均在實(shí)驗(yàn)開始第1日腹腔注射上述方法配制的鏈脲佐菌素，劑量為60mg/kg。DM+GBE組給予GBE干預(yù)，灌胃前使用0.9%氯化鈉注射液將藥物稀釋，劑量為 96 mg/（kg·d），每日 1 次灌胃，連續(xù) 12周。對照組、DM組均以0.9%氯化鈉注射液以同等劑量灌胃［10］。采用強(qiáng)生公司血糖儀進(jìn)行機(jī)測血糖的監(jiān)測，每周檢測1次，共12周。糖尿病模型大鼠的診斷標(biāo)準(zhǔn)：72 h后靜脈采血血糖濃度≥16.7 mmol/L時可確定建模成功，將大鼠納入DM模型范疇中，此模型在構(gòu)建過程中具有胰島素抵抗、高血脂、高血糖及典型糖尿病腎病的特點(diǎn)［9］。

1.4 一般情況觀察 在飼養(yǎng)及模型建立過程中觀察動物的一般活動情況，每日飲水及進(jìn)食情況，精神狀態(tài)及活動，并每周測量體質(zhì)量1次

1.5 標(biāo)本采集及檢測 研究開始及每周取尾尖血用快速血糖儀監(jiān)測血糖水平。治療結(jié)束后全部試驗(yàn)大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，開胸，經(jīng)心臟抽全血，抗凝、離心，分離血清和紅細(xì)胞，將血清至于EP管，ELISA技術(shù)檢測血清TNF-α、IL-1β水平。部分血液培養(yǎng)于含有10%FBS和抗生素（100 U/mL青霉素100μg/mL鏈霉素）DMEM培養(yǎng)基中，過夜后去除上清液，獲得巰基醋酸鹽誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用定量PCR檢測NLRP3、ASC、IL-1βmRNA表達(dá)。心臟取血后，迅速取出雙腎，經(jīng)預(yù)冷的9%氯化鈉注射液灌洗，至整個腎顏色變蒼白后，游離、去除包膜，稱重；取右腎，按冠狀位縱行剖開，取腎皮質(zhì)4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，蠟塊制作，切片，貼片后嚴(yán)格按試劑盒操作步驟進(jìn)行，采用免疫組化 ABC 法檢測 Caspase-1、IL-1β、IL-18，行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 模型建立及銀杏葉干預(yù)過程中，對照組大鼠體質(zhì)量增加迅速，進(jìn)食飲水狀態(tài)可，自主活動良好及反應(yīng)能力靈敏，精神狀態(tài)佳，毛有光澤。DM組：進(jìn)食及飲食較對照組增加，但反應(yīng)能力較遲鈍，自主活動減少，毛色差。DM+GBE組：自主活動及反應(yīng)能力較DM組好轉(zhuǎn)，毛色較晦暗。

2.2 各組大鼠造模及治療期間體質(zhì)量比較 見表1。研究開始時，各組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在第6周時，DM組大鼠體質(zhì)量降低，但與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在12周時與對照組相比較，DM組大鼠體重明顯降低（P＜0.01）；與DM組相比較，DM+GBE組體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）。

表1 各組大鼠造模及治療期間體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠造模及治療期間體質(zhì)量比較（g，±s）

與對照組相比較，△P＜0.05；與 DM 組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01，※P＞0.05。下同。

n 研究開始24 265.31±11.01 DM 組 273.82±28.43 265.12±21.43△組 別 第6周 第12周對照組 290.21±11.36 309.21±12.03 24 271.21±18.02 DM+GBE 組 24 267.21±9.03 281.33±18.12 301.12±26.01*

2.2 各組血糖水平比較 見表2。血糖水平在研究開始各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比較，第6周及第12周時，血糖水平明顯升高（P＜0.01）。與DM組相比較，DM+GBE組血糖水平降低（P＜0.05）。

表2 各組血糖水平比較（±s）

表2 各組血糖水平比較（±s）

n 造模前24 87.04±7.13 DM 組 367.12±101.82△ 327.32±140.31△組 別 第6周 第12周對照組 86.01±8.83 90.12±11.21 24 87.12±6.11 DM+GBE 組 24 85.12±3.65 346.21±19.04* 2000.2±74.31*

2.3 各組腎皮質(zhì)IL-1β、IL-18和Caspase-1水平比較組間Caspase-1的水平相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。但是與對照組相比較，DM組大鼠IL-1β、IL-18的水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與DM組相比較，DM+GBE組大鼠IL-1β、IL-18水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組腎皮質(zhì)IL-1β、Caspase-1和IL-18水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組腎皮質(zhì)IL-1β、Caspase-1和IL-18水平比較（pg/mL，±s）

n IL-1β 24 53.61±6.31 DM 組 0.71±0.04 3.32±1.73△組 別 Caspase-1 IL-18對照組 0.72±0.13 2.12±0.39 24 93.21±42.41△DM+GBE 組 24 42.73±9.12** 0.81±0.12※ 2.12±0.43*

2.4 各組NLRP3炎性體相關(guān)分子表達(dá)水平的比較見表 4。與對照組相比較，DM 組 NlRP3、ASC、IL-1β 的mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）；與 DM組相比較，DM+GBE組 NlRP3、ASC、IL-1β 的 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）。

表4 各組NLRP3炎性體相關(guān)分子表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組NLRP3炎性體相關(guān)分子表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

n NLPR 24 2.78±0.23 DM 組 6.95±0.82△ 4.98±0.45△組 別 ASC IL-1β對照組 4.63±0.31 3.68±0.28 24 3.76±0.26△DM+GBE 組 24 3.16±0.25** 5.28±0.35** 4.15±0.83**

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的比較 見表5。與對照組相比較，DM組TNF-α、IL-1β水平均升高（P＜0.05）； 與 DM 組相比較，DM+GBE 組 TNF-α、IL-1β 水平均下降（P＜0.05）。

表5 各組大鼠血清 TNF-α、IL-1β 水平比較（pg/mL，±s）

表5 各組大鼠血清 TNF-α、IL-1β 水平比較（pg/mL，±s）

組 別 IL-1β對照組 25.62±1.61 n TNF-α 24 38.63±5.68 DM 組 42.59±2.05△24 69.81±1.75△DM+GBE 組 24 41.54±6.42** 39.72±3.44.43**

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，2型糖尿病患者中50%在診斷為糖尿病同時就存在腎臟損害，糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。主要治療措施是早期干預(yù)各種危險因素及終末期的腎臟替代治療。所以如何早期控制血糖，減緩糖尿病腎病進(jìn)程，保護(hù)腎臟是目前研究的熱點(diǎn)。

糖尿病腎病的明確發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，近幾年研究表明NLRP3炎性體的激活參與了糖尿病腎病的病理過程。NLRP3是活化Caspase-1的分子平臺，能夠調(diào)控IL-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子的成熟和分泌［11-12］，IL-1β細(xì)胞因子是糖尿病腎病炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)器，表達(dá)增加近端小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生透明質(zhì)酸增多，進(jìn)而導(dǎo)致血管上皮細(xì)胞的滲透性增加，與糖尿病各種慢性并發(fā)癥具有直接關(guān)系。既往研究證明高糖可以促進(jìn)人足細(xì)胞及鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DN小鼠模型NLRP3炎性小體的表達(dá)及激活，沉默NLRP3/ASC基因或抑制Caspase-1的活性均可阻止高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞NLRP3炎性小體激活和損傷，由此可以看出NLRP3炎性小體可以引起DN患者的腎小球損傷［13］。這些證據(jù)提示NLRP3 mRNA的水平和腎功能的高低明顯相關(guān)，阻止病理性炎性體的激活應(yīng)是未來治療腎臟病的一種重要手段。

本研究中，造模后DM組大鼠較對照組血糖增高，體質(zhì)量降低，提示造模成功，經(jīng)銀杏葉提取物干預(yù)后，血糖水平下降，體重較DM組增加，提示銀杏葉提取物有有降低血糖、改善糖耐量的作用。對腎皮質(zhì)IL-1β、IL-18和Caspase-1進(jìn)行了分析，我們發(fā)現(xiàn)，DM組IL-1β、IL-18水平較對照組增加，經(jīng)銀杏葉提取物干預(yù)后水平下降，提示銀杏葉提取物有減弱炎性反應(yīng)的作用，但在試驗(yàn)中，Caspase-1組間比較無變化，值得進(jìn)一步研究。為了進(jìn)一步研究銀杏葉腎臟保護(hù)的機(jī)制，我們對NlRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達(dá)及血清TNF-α、IL-1β進(jìn)行了分析，研究中DM組大鼠Nl-RP3、ASC、IL-1β 及血清中 TNF-α、IL-1β 表達(dá)均增高，與既往研究一致，提示炎性復(fù)合物參與了糖尿病腎病的發(fā)病及進(jìn)展，經(jīng)銀杏葉提取物干預(yù)后炎性復(fù)合體表達(dá)下降，提示銀杏葉提取物有減弱炎性反應(yīng)的作用。

銀杏葉提取物是一種常見的中藥活性成分，用于治療多種疾病。GEB的主要活性成分有黃酮苷和銀杏內(nèi)酯，有抗血小板聚集、改善血流動力學(xué)、抗氧化應(yīng)激、抑制腎小管上皮細(xì)胞調(diào)亡等作用［14-15］。本研究表明，銀杏葉提取物可降低糖尿病大鼠的血糖水平，增加糖尿病大鼠體質(zhì)量，能減弱糖尿病大鼠炎性反應(yīng)，起到保護(hù)腎臟的作用。這可能是銀杏葉提取物延緩糖尿病腎病進(jìn)展的機(jī)制之一。

綜上所述，NLRP3相關(guān)炎性因子的表達(dá)及分化可能參與DN的發(fā)生及進(jìn)展，經(jīng)銀杏葉提取物干預(yù)后，炎癥減輕，提示銀杏葉提取物腎臟保護(hù)機(jī)制可能是通過抑制NLRP3的活性來實(shí)現(xiàn)的。為臨床治療DN提供了新途徑，應(yīng)用前景廣闊，值得進(jìn)一步研究、開發(fā)。

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