寧 娜，朱飛鵬，王和枚，賀學(xué)林，3，韓 玲

（1.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心，北京 100038；2.北京昭衍新藥研究中心股份有限公司，北京 100176；3.浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州 310003）

腎是藥物或其毒性代謝產(chǎn)物富集、排泄的重要器官。近年來(lái)，因疾病譜復(fù)雜化、聯(lián)合用藥等，藥源性腎毒性已成為導(dǎo)致急性腎損傷的重要原因之一［1］。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，全球進(jìn)入非臨床研究階段的候選化合物只有7%因腎毒性而中止［2］，非臨床研究的腎毒性評(píng)價(jià)可能被低估。非臨床安全性評(píng)價(jià)中，可提示腎毒性風(fēng)險(xiǎn)的常規(guī)指標(biāo)包括尿量、尿蛋白、血清肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和組織病理學(xué)觀察結(jié)果等，如何對(duì)異常指標(biāo)進(jìn)行深入評(píng)價(jià)是新藥非臨床研究及后續(xù)臨床試驗(yàn)中需要重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。本文對(duì)非臨床腎毒性指標(biāo)及其評(píng)價(jià)思路進(jìn)行綜述，為臨床試驗(yàn)中風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)的設(shè)置提供參考。

1 腎毒性指標(biāo)異常與藥物的相關(guān)性

在非臨床安全性評(píng)價(jià)中，直接或間接反映腎損傷的檢查項(xiàng)目主要包括針對(duì)尿液和血液的臨床病理學(xué)檢查，以及針對(duì)腎的大體解剖和組織病理學(xué)檢查。臨床病理學(xué)檢查中，尿檢的主要指標(biāo)包括尿量、尿蛋白、尿潛血、尿糖和酸堿度；血液學(xué)指標(biāo)包括紅細(xì)胞系數(shù)（紅細(xì)胞、血紅蛋白和紅細(xì)胞比容）及相關(guān)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)等；血生化指標(biāo)包括Cr、BUN、尿酸和電解質(zhì)含量（如磷、鈣和鉀）等，可從不同的角度反映腎功能減退的程度和持續(xù)的時(shí)間。而腎的組織病理學(xué)病變一般先于臨床病理學(xué)指標(biāo)出現(xiàn)［2］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)染色法（如蘇木精-伊紅染色等），可觀察大部分的病理變化，如空泡變、色素沉積、細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。

非臨床安全性評(píng)價(jià)應(yīng)綜合考慮多個(gè)指標(biāo)的相互印證，判斷其與藥物的相關(guān)性。如某案例中，給藥后雄性大鼠出現(xiàn)尿蛋白陽(yáng)性，組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)腎近端小管上皮內(nèi)存在輕度玻璃樣小滴和散在的透明管型等病理改變。由于不良反應(yīng)的嚴(yán)重程度存在性別差異，研究者初步推斷可能與雄性大鼠特有的α2u球蛋白腎病有關(guān)。α2u球蛋白是正常大鼠肝合成的一種小分子蛋白質(zhì)，經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)，約50%在近端小管重吸收，溶酶體降解。α2u球蛋白腎病具有性別和物種特異性，只發(fā)生于雄性大鼠。外源性物質(zhì)如與α2u球蛋白發(fā)生可逆性結(jié)合，可降低溶酶體蛋白酶的降解能力，導(dǎo)致其在溶酶體內(nèi)蓄積，使溶酶體數(shù)量增加、體積增大，從而在近端小管S2段形成特征性的玻璃樣小滴蓄積，進(jìn)而發(fā)生單個(gè)細(xì)胞壞死、近端小管和髓袢細(xì)段連接處出現(xiàn)顆粒管型等病理改變［3］。人類很少或不存在這種蛋白。若能確定尿蛋白陽(yáng)性和組織病理學(xué)的玻璃樣小滴、透明管型是由α2u球蛋白引起的，則可認(rèn)為該藥物在臨床使用不會(huì)引起類似腎毒性［4］。但是，非臨床安全性評(píng)價(jià)是一個(gè)客觀、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治雠c評(píng)價(jià)過(guò)程，不能僅根據(jù)單個(gè)組織病理學(xué)觀察結(jié)果疑似種屬特異性病變，就得出與人不相關(guān)的結(jié)論。該案例的數(shù)據(jù)鏈缺少玻璃樣小滴是α2u球蛋白所致的直接證據(jù)，尚不能推斷尿蛋白陽(yáng)性及玻璃樣小滴變性因α2u球蛋白引起。為此，研究者進(jìn)一步使用α2u球蛋白抗體進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果未見(jiàn)抗原抗體結(jié)合的陽(yáng)性染色，直接排除了玻璃樣小滴為α2u球蛋白的可能性。同時(shí)，對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的腎組織病理學(xué)切片進(jìn)行復(fù)閱，發(fā)現(xiàn)除近曲小管的玻璃樣小滴外，尚可見(jiàn)腎小管嗜堿性病變、上皮細(xì)胞變性、胞漿嗜堿性和透明管型等嚴(yán)重程度呈劑量相關(guān)性。上述變化與慢性進(jìn)行性腎?。╟hronic progressive nephropathy，CPN）的早期組織病理學(xué)變化基本一致［5］。CPN是實(shí)驗(yàn)大鼠高發(fā)的自發(fā)性腎病，發(fā)病率和嚴(yán)重程度受到蛋白質(zhì)或熱量攝入、雄性激素、腎蛋白處理能力等多種因素的影響，最早在大鼠2～3月齡時(shí)即可出現(xiàn)［6-7］。但是，案例中腎小管嗜堿性病變和部分上皮細(xì)胞變性等病變的嚴(yán)重程度與藥物劑量相關(guān)，無(wú)法排除上述病變與給藥的相關(guān)性。但根據(jù)組織病理學(xué)檢查結(jié)果中多個(gè)特征性改變，本案例認(rèn)可近曲小管的玻璃樣小滴為大鼠自發(fā)性病變CPN的表現(xiàn)，但藥物促進(jìn)了自發(fā)性腎病的發(fā)生與發(fā)展。至此，研究者應(yīng)根據(jù)藥物相關(guān)不良反應(yīng)的嚴(yán)重程度、可逆性等進(jìn)行利弊權(quán)衡，判斷是否在非臨床研究階段中止研究，還是在后續(xù)臨床試驗(yàn)中將腎毒性作為風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)進(jìn)行嚴(yán)格控制。

完整的數(shù)據(jù)鏈?zhǔn)穷A(yù)測(cè)臨床腎毒性的必要條件。非臨床安全性評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)對(duì)異常病理指標(biāo)進(jìn)行充分分析和解讀，根據(jù)相互印證的數(shù)據(jù)判斷病變出現(xiàn)的類型、嚴(yán)重程度、進(jìn)展情況與藥物理化性質(zhì)、給藥劑量、動(dòng)物性別等的相關(guān)性，分析病變出現(xiàn)的原因以及藥物導(dǎo)致腎損傷的可能機(jī)制，提示臨床使用的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)。同時(shí)，充分考慮種屬特異性病變或動(dòng)物自發(fā)性病變的特殊表現(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不良反應(yīng)進(jìn)行對(duì)比，有針對(duì)地進(jìn)行確證后，方可排除與藥物的相關(guān)性。

2 非臨床腎毒性指標(biāo)的進(jìn)一步探索

在新藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中，考察指標(biāo)的局限性可能將影響毒性評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。組織病理學(xué)檢查受到取樣和工作量的限制，而臨床病理學(xué)的常規(guī)指標(biāo)中，尿蛋白、血清Cr和BUN等的變化對(duì)于提示腎早期病變相對(duì)滯后，血清鈣磷代謝的異常等主要反映晚期慢性腎功能障礙，同時(shí)也缺乏特異性。探索早期、敏感的檢查指標(biāo)是改善非臨床腎毒性低估的重要途徑之一。作為反映腎損傷的生物標(biāo)志物，應(yīng)滿足下列條件：①樣本獲取簡(jiǎn)易，室溫下穩(wěn)定；②正常情況下，在腎中表達(dá)水平較低或不表達(dá)，損傷后表達(dá)明顯增加；③腎功能恢復(fù)前穩(wěn)定表達(dá)；④表達(dá)水平達(dá)到臨床病理學(xué)分析的檢測(cè)限。目前，人用藥物技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)委員會(huì)（International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）認(rèn)可7種早期腎損傷的尿生物標(biāo)志物，分別為白蛋白、β-微球蛋白、血清胱抑素C（cystatin C）、腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，Kim-1）、三葉肽因子 3（trefoil factor 3，Tff3）、叢生蛋白（clusterin）和腎乳頭抗原1（renal papillary antigen-1，RPA-1）［2］，作為常規(guī)指標(biāo)尿蛋白、血清Cr和BUN的補(bǔ)充，可用于非臨床腎毒性的評(píng)價(jià)。白蛋白因同性電荷相斥作用而無(wú)法通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜，可用于判定腎小球?yàn)V過(guò)膜功能變化。β-微球蛋白和血清胱抑素C的相對(duì)分子質(zhì)量較小，且不與其他蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，可自由地經(jīng)腎小球過(guò)濾到原尿中，在近曲小管重吸收并代謝分解，可反映腎小球?yàn)V過(guò)功能和近端腎小管重吸收功能。Kim-1是近曲小管上皮細(xì)胞的一種跨膜糖蛋白，在受損后再生的細(xì)胞中高表達(dá)，可較早地反映近曲小管的損傷程度。Tff3是一種小分子肽類激素，主要由上皮細(xì)胞分泌。叢生蛋白是一種細(xì)胞外糖蛋白，腎急性缺血時(shí)表達(dá)增加。RPA-1是一種特異性分布在腎集合管的膜結(jié)合糖蛋白，與腎乳頭損傷程度有較好的相關(guān)性。在安全性評(píng)價(jià)中，敏感的檢查指標(biāo)可及時(shí)、快速地反映腎毒性，甚至在更早期的候選化合物發(fā)現(xiàn)階段，通過(guò)體外篩選實(shí)驗(yàn)等即可提示化合物的腎毒性。

腎組織病理學(xué)改變?nèi)匀皇欠桥R床腎毒性評(píng)價(jià)的金指標(biāo)［2］。常規(guī)組織病理學(xué)檢測(cè)如不能滿足對(duì)病變部位和性質(zhì)的鑒別，則需要進(jìn)行特殊染色處理，如過(guò)碘酸六胺銀染色（periodic acid-silver methera?mine，PASM）、過(guò)碘酸-希夫染色（periodic acid-Schiff stain，PAS）染色和Masson染色等；同時(shí)，可通過(guò)特殊生物標(biāo)志物檢測(cè)和電鏡觀察等進(jìn)一步明確病變特征，分析病理機(jī)制。組織病理學(xué)檢測(cè)對(duì)病理診斷人員要求較高，不同診斷人員常得出不同的病理檢查結(jié)果。因此，應(yīng)統(tǒng)一病理診斷術(shù)語(yǔ)，并開(kāi)展病理學(xué)家的資質(zhì)認(rèn)證，提高病理診斷質(zhì)量。組織病理學(xué)診斷術(shù)語(yǔ)和診斷標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)際規(guī)范即大小鼠損傷命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際協(xié)調(diào)規(guī)范（International Harmonization of Nomenclature and Diagnostic Criteria for Lesion in Rats and Mice）對(duì)大小鼠的增生與非增生性病變術(shù)語(yǔ)與診斷標(biāo)準(zhǔn)已做了統(tǒng)一規(guī)定，對(duì)規(guī)范病理診斷、促進(jìn)國(guó)際間或不同機(jī)構(gòu)間病理學(xué)家以及藥物監(jiān)管部門之間交流起到了積極的推動(dòng)作用，受到廣泛認(rèn)可。國(guó)內(nèi)毒性病理學(xué)專業(yè)人員及藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)應(yīng)盡快熟悉或了解。在日常藥物非臨床研究的病理檢測(cè)中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要開(kāi)展必要的內(nèi)部或外部組織病理學(xué)檢查同行評(píng)議，確保病理學(xué)檢查結(jié)論準(zhǔn)確可信。

3 結(jié)語(yǔ)

新藥研發(fā)是一個(gè)依據(jù)數(shù)據(jù)不斷向前推進(jìn)的風(fēng)險(xiǎn)控制過(guò)程。非臨床安全性研究是其中不可或缺的重要環(huán)節(jié)，可為臨床試驗(yàn)提示需關(guān)注的用藥風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，并為藥物上市后安全、合理用藥提供數(shù)據(jù)支撐。在某些方面，還可預(yù)測(cè)臨床研究中監(jiān)測(cè)指標(biāo)不能反映出來(lái)的潛在毒性。在對(duì)新藥腎毒性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估時(shí)，應(yīng)結(jié)合完整的非臨床安全性研究數(shù)據(jù)鏈，總結(jié)病變的發(fā)生率、嚴(yán)重程度和可逆性，分析與藥物劑量的相關(guān)性；同時(shí)綜合藥物作用機(jī)制、動(dòng)物種屬特點(diǎn)及自發(fā)性病變研究等進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)與人的相關(guān)性，以降低臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)。