修雨婷，王愛馥，張 奇，劉林林

(吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤,也是癌癥死因之首[1]，中晚期患者5年生存率僅 10% 左右，但有臨床證據(jù)顯示 I期肺癌患者 10年生存率可高達 90% 以上。由于早期患者缺乏特異癥狀，患者首次就診時大多為中晚期，因此建立能夠用于大范圍人群早期發(fā)現(xiàn)肺癌的指標和方法,是提高其早期發(fā)現(xiàn)率 ,從而降低死亡率的關鍵問題。

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，幾種循環(huán)自身抗體與癌癥密切相關。例如食管鱗癌患者CD25自身抗體水平、非小細胞肺癌患者P16自身抗體及宮頸癌患者FOXP3自身抗體水平與健康對照者相比顯著升高[2-4]。癌癥患者自身抗體異常分泌的機制尚未完全闡明，但大多數(shù)學者認為免疫監(jiān)視是自身抗體異常表達的主要原因。免疫原性部分來源于腫瘤特有的新抗原的產(chǎn)生，但更大程度上來源于腫瘤細胞中異常表達的自身抗原，這些異?？乖环Q為腫瘤相關性抗原(TAAs)，可被免疫系統(tǒng)識別，并通過產(chǎn)生自身抗體來實現(xiàn)殺死腫瘤細胞的目的[5]?；谶@種抗原-抗體反應，在早期腫瘤診斷中，針對TAAs的自身抗體的檢測比直接TAAs檢測更敏感。

Survivin位于染色體17q25，是凋亡抑制劑(IAP)家族的成員，它是一種能夠調(diào)控細胞分裂、抑制凋亡和促進血管生成的多功能蛋白質(zhì)[6]。由于在成熟器官或組織癌細胞中顯著的特異性過度表達，Survivin近年來成為癌癥早期診斷熱門的生物標志物。本研究應用改良的ELISA方法檢測非小細胞肺癌患者血清中Survivin循環(huán)自身抗體水平，探討其在267例非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中可能存在的臨床意義及診斷價值。

1 材料與方法

1.1研究對象

研究對象為267例吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院首診為肺癌的患者，平均年齡60.0±9.8歲，并具備完整臨床資料信息，確診及分期依據(jù)為影像學及病理學檢查，在進行任何抗癌治療之前采集血樣。同時收集362名健康受試者血清，平均年齡50.7±8.4歲，排除任何惡性腫瘤史，肺癌組與對照組均無嚴重的自身免疫病病史。入組對象均為中國漢族，并簽署書面知情同意書參與本研究，實驗內(nèi)容獲得吉林大學倫理委員會批準。

1.2實驗方法

Survivin蛋白(純度>95%)以20 μg/mL溶于包被緩沖液中，100 μL/孔，4℃靜置過夜；棄去孔內(nèi)液體，200 μl洗液洗板3次，包被緩沖液稀釋谷氨酸至 10 mg/mL，每孔加樣 200 μl，37℃孵育1 h；200 μl 洗液洗板3次，BSA分析液稀釋肺癌患者及健康對照者血清至目標濃度 1∶200，每孔加樣 100 μl，37℃孵育1.5 h；200 μl洗液洗板3次，每孔100 μl 1∶40 000分析液稀釋的羊抗人IgG-HRP， 37℃孵育1 h；200 μl洗液洗板3次，100 μl TMB顯色液，37℃避光顯色30 min；50 μl終止液終止顯色反應，自動酶標儀上讀取450 nm-620 nm處OD值。BSA分析液作為陰性對照孔，200份健康人血清混合的QC作為陽性控制孔。

1.3自身抗體檢測

本研究通過對目的蛋白結構的分析和表位預測設計，把多肽片段而不是傳統(tǒng)的重組蛋白作為酶標板包被抗原。應用改良的ELISA方法檢測Survivin特異性自身抗體,并將特異性結合指數(shù)(SBI)表達循環(huán)自身抗體的水平：SBI=[Survivin(OD)-NC(OD)/ QC(OD)-NC(OD)]。

1.4數(shù)據(jù)分析

本研究應用Microsoft Excel 2010構建SBI值數(shù)據(jù)庫，并計算mean±SD 值作為最終數(shù)據(jù)。 采用IBM SPSS Statistics 21.0進行Student t檢驗，比較肺癌患者組與對照組之間的SBI差異，并進行ROC曲線分析。

2 結果

2.1肺癌組患者與健康對照組Survivin自身抗體表達水平

Survivin自身抗體在肺癌組(mean±SD 1.027±0.521)表達顯著高于對照組(0.859±0.279，P=0.000)。進一步比較肺癌不同期別Survivin自身抗體的表達，結果顯示：Ⅰ期-Ⅱ期(1.067±0.710)肺癌中Survivin自身抗體的表達雖高于Ⅲ-Ⅳ期(0.993±0.270)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義。

2.2ROC曲線分析

肺癌中Survivin自身抗體AUC為0.713(SE=0.020,95%CI 0.673-0.753)。在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌中，AUC值為0.731(SE=0.023,95%CI 0.687-0.776)，90%特異性對應的敏感性為18.7%；Ⅲ-Ⅳ期肺癌中，AUC值為0.697(SE=0.024,95%CI 0.651-0.744)，90%特異性對應的敏感性為16.7%。

表1 非小細胞肺癌患者組和健康對照組Survivin自身抗體的表達水平

表2 非小細胞肺癌患者組和健康對照組Survivin自身抗體表達的ROC分析

3 討論

許多研究證明TAAs自身抗體的異常升高與癌癥的發(fā)生有關。Wang et al.[7]發(fā)現(xiàn)前列腺癌的檢測中，聯(lián)合抗原檢測與單一前列腺特異性抗原(PSA)相比靈敏度和特異性顯著升高。且去除“免疫原”后，5例接受前列腺切除術的患者表達的自身抗體減少。在另一項研究中，Joseph et al.發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(OPN)循環(huán)自身抗體可作為CT篩查的輔助診斷生物標志物，以提高早期NSCLC和高危組患者的特異性[8]。此外NSCLC期別越晚，OPN自身抗體水平越高。一項評估谷胱甘肽S-轉移酶1(GSTO1)在食管鱗癌診斷價值的研究中，食管鱗癌患者自身抗體對GSTO1的陽性百分比為44.8%，而健康者中僅為6.7%[9]?？偟膩碚f，研究者認為自身抗體水平的改變有助于診斷癌癥。

圖1 非小細胞肺癌患者組和健康對照組Survivin自身抗體的表達ROC曲線

Allen et al.[10]首先發(fā)現(xiàn)IAP的過度表達可導致乳頭狀瘤轉化為鱗狀細胞癌的可能性增加,但在之后的試驗中他們發(fā)現(xiàn)，Survivin水平較高的小鼠乳頭狀瘤形成較少,這表明Survivin蛋白參與腫瘤進展而不是其產(chǎn)生。還有許多研究證實，食管癌、肺癌、乳腺癌和肝癌患者Survivin蛋白的表達明顯改變[11-14]，Survivin在癌癥的進展中起著至關重要的作用，可以作為早期發(fā)現(xiàn)的潛在生物標志物。癌癥患者Survivin上調(diào)機制尚未完全了解，有研究表明，Survivin蛋白的上調(diào)可阻止細胞程序性死亡，并使得癌細胞通過G2-M檢查點，進而繁殖生長[15]。

Vaios et al.報道肺癌患者Survivin自身抗體的過表達頻率為7.7%，健康對照組為2.6%和2%[16]。與其結果一致，我們同樣發(fā)現(xiàn)Survivin自身抗體在肺癌患者中顯著過表達，90%的特異性對應敏感性為17.2%。同時我們進一步檢測了Survivin自身抗體在不同期別肺癌的表達趨勢，結果表明，隨著肺癌的進展，自身抗體水平逐漸降低。這些結果進一步揭示了自身抗體對肺癌早期診斷中Survivin的潛在作用。雖然Survivin自身抗體在肺癌中的敏感性不能滿足早期檢測的臨床要求，但與其他TAAs自身抗體的聯(lián)合可以提高檢測靈敏度,多種TAAs自身抗體聯(lián)合檢測也是目前提高腫瘤診斷敏感性和特異性的主要手段。

多種TAAs自身抗體的聯(lián)合檢測可以有效提高診斷敏感性和特異性，但TAAs成員應具有相對優(yōu)越的特異性和靈敏度。早期肺癌診斷試劑盒EARLY-CDT作為基于TAAs自身抗體理論的第一個試劑盒包括7個TAA，其靈敏度達到49%。 Survivin的線性抗原肽能否作為肺癌早期診斷試劑盒的候選成員，可以提高檢測靈敏度和特異性，但仍需進一步驗證。

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