路 明，李艷麗，高 峰，王春文

(1.吉林市中心醫(yī)院 基本外科 ，吉林 吉林132000；2.吉林省疾病預(yù)防控制中心；3.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院；4.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

胃癌(GC)為我國(guó)現(xiàn)階段發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，每年有超過16萬人死于胃癌[1,2]。造成胃癌患者死亡的主要原因在于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，如何早期預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于個(gè)體化治療，提高患者生存質(zhì)量及延長(zhǎng)患者生存期具有一定意義。研究顯示RacGCT酶活性蛋白-1(RacGAP1)和微球蛋白1(MCRS1)在肺癌和直腸癌等惡性腫瘤中存在高表達(dá)[3,4]。本文探討RacGAP1與MCRS1在淋巴轉(zhuǎn)移胃癌組織中表達(dá)及對(duì)生存時(shí)間的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2014年5月-2015年4月來我院就診且確診為胃癌的患者126例為研究對(duì)象。所有患者均行腹腔境胃癌根治術(shù)(D2清掃)，留取腫瘤組織。所有組織標(biāo)本均為新鮮組織，經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃癌，根據(jù)是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組45例和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組81例。兩組的一般情況具有可比性。另外，選取同時(shí)期行胃鏡檢查的15例為對(duì)照組，結(jié)果為正常胃黏膜。納入標(biāo)準(zhǔn)： 均經(jīng)過病理檢查確診，且均為首次確診；無其他腸道疾病；近期未服用影響RacGAP1與MCRS1表達(dá)的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18周歲；術(shù)前接受放化療；拒絕參與本項(xiàng)研究者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，組織標(biāo)本的取得均獲得患者及家屬簽署的知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測(cè)為組織的RacGAP1與MCRS1表達(dá)選取2014年5月至2015年4月來我院就診且確診為胃癌的患者126例為研究對(duì)象。所有患者均行腹腔鏡下胃癌根治術(shù)(D2清掃)。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果，按是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分為45例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和81例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。兩組的一般情況具有可比性。另外，選取同時(shí)期行胃鏡檢查，結(jié)果為正常胃黏膜的15例為對(duì)照。組織標(biāo)本的取得及檢測(cè)均獲得患者或家屬知情同意，本課題經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 取“1.2.1”項(xiàng)下胃組織，用無菌、無RNase的EP管，加入Trizol裂解液1.0 ml，在4 ℃下將標(biāo)本剪成小塊并研磨至液體澄清，移至新EP管中，加氯仿混勻，高速離心3 min，取上層水相0.5 ml，加0.5 ml異丙醇，混勻，去上 層，可得總RNA。以MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶與引物行RT-PCR，互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)合成體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42℃60 min，95℃5 min。檢測(cè)RacGAP1mRNA與MCRS1mRNA相對(duì)表達(dá)，b-actin為內(nèi)參。RNA 提取試劑盒、PCR 反應(yīng)試劑盒和RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)，RacGAP1及MCRS1引物(上海生工生物工程股份有限公司)。擴(kuò)增條件：94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72℃ 60 s，40循環(huán)后，72 ℃5min。將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，置于紫外燈下，采用Image J軟件分析并計(jì)算RacGAP1mRNA 與MCRS1mRNA的相對(duì)含量，引物序列見表1。

表1 RacGAP1和MCRS1的序列

1.2.3隨訪 對(duì)所有胃癌患者進(jìn)行為期2.5年的隨訪，隨訪方式：復(fù)診、電話、微信和郵件等，隨訪終點(diǎn)為患者死亡和/或隨訪時(shí)間截止(2017年9月14日)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS19.0軟件處理本課題所得數(shù)據(jù)，胃組織的RacGAP1和MCRS1及RacGAP1mRNA和MCRS1mRNA表達(dá)等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，男女比例及分化程度等計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13組的一般臨床信息比較3組的性別、年齡和體重指數(shù)等一般臨床信息具有可比性(P>0.05)，2組胃癌患者的分化程度、腫瘤大小及Hp感染等情況具有可比性(P>0.05)，見表2。

表2 3組的一般臨床信息比較

2.23組受試者胃組織的RacGAP1和MCRS1及RacGAP1mRNA和MCRS1mRNA表達(dá)與對(duì)照組比，胃癌組織的RacGAP1與MCRS1及RacGAP1mRNA和MCRS1mRNA均呈高表達(dá)(P<0.05)，但與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織的RacGAP1與MCRS1及RacGAP1mRNA和MCRS1mRNA表達(dá)均較高(P<0.05)，見表3、圖1和圖2。

表3 3組受試者胃組織的RacGAP1和MCRS1及RacGAP1mRNA和MCRS1mRNA表達(dá)(%)

與對(duì)照組比，*P<0.05，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)組比，&P<0.05。

1：對(duì)照組；2：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；3：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組

1：對(duì)照組；2：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；3：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組

2.3胃癌患者的2.5年生存時(shí)間比較2.5年內(nèi)126例胃癌患者均獲得隨訪，死亡29例(23.02%)，存活97例(76.98%)，死亡29例患者均無意外死亡。與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)組66.67%(30/45)相比，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組82.72%(67/81)的生存率較高(χ2=4.201,P=0.040)。將RacGAP1或RacGAP1mRNA按高至低排序，中位數(shù)以上為高表達(dá)，中位數(shù)及以下為低表達(dá)，結(jié)果顯示，與高表達(dá)44/63(69.84%)相比，低表達(dá)54/63(85.71%)生存率較高(χ2=5.185,P=0.023)，將MCRS1或MCRS1 mRNA按高至低排序，中位數(shù)以上為高表達(dá)，中位數(shù)及以下為低表達(dá)，結(jié)果顯示，與高表達(dá)43/63(68.25%)相比，低表達(dá)55/63(87.30%)生存率較高(χ2=7.290,P=0.007)。

3 討論

RacGAP1是GTP 酶活性蛋白家族的一員，RacGAP1作為細(xì) 胞 增 殖 的 標(biāo) 志 物參與細(xì)胞分裂增殖過程，研究報(bào)道RacGAP1在肝細(xì)胞癌、乳腺癌及腦膜瘤等惡性腫瘤組織中過表達(dá)，RacGAP1過表達(dá)可以作為評(píng)估腫瘤高侵襲性的標(biāo)志，如RacGAP1mRNA過表達(dá)與癌復(fù)發(fā)及預(yù)后不良相關(guān)[5,6]。本課題結(jié)果顯示RacGAP1蛋白或mRNA在胃癌組織存在高表達(dá)的情況，且高表達(dá)伴隨淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移，影響患者的生存時(shí)間，與RacGAP1加速胃癌的發(fā)病過程相關(guān)，其機(jī)理如下[7-10]：1)Hp感染是誘導(dǎo)胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，Hp可通過增加RacGAP1mRNA表達(dá)來提高組織內(nèi)RacGAP1蛋白表達(dá)，與Hp可將RacGAP1的DNP轉(zhuǎn)換到胃黏膜細(xì)胞，誘導(dǎo)癌變發(fā)生。2)RacGAP1可調(diào)節(jié)Rac和cdc42的活性，重構(gòu)細(xì)胞骨架，使得細(xì)胞極重排，改變細(xì)胞形態(tài)，降低癌組織與周圍正常組織的黏附，為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，上調(diào)的Rac和cdc42還能增強(qiáng)癌細(xì)胞的耐藥性，抑制癌組織對(duì)化療的敏感度。3)RacGAP1通過影響核心蛋白復(fù)合體-1表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，干擾細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)癌細(xì)胞向周圍轉(zhuǎn)移。

MCRS1蛋白由462個(gè)氨基酸(aa)組成，主要定位在核仁和中心體，MCRS1在惡性腫瘤發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程及生存情況發(fā)揮重要作用，可能機(jī)理有以下幾點(diǎn)[11,12]：1)MCRS1表達(dá)受細(xì)胞周期調(diào)控，一般初始表達(dá)在細(xì)胞G1期末，在S期早期高峰表達(dá)，S期晚期表達(dá)降低，通過轉(zhuǎn)錄與調(diào)節(jié)途徑參與細(xì)胞的增殖分化。其中，MCRS1作為細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，MCRS1在細(xì)胞核內(nèi)與STRA13、Mi-2β和轉(zhuǎn)錄因子Daxx相互作用，或與NDRG2共同影響細(xì)胞分化和腫瘤細(xì)胞增殖，或與單純皰疹病毒1型的核調(diào)節(jié)蛋白ICP22協(xié)同作用，并以細(xì)胞周期依賴的方式積聚。2)MCRS1與中心體Nde1及SU48形成蛋白復(fù)合物定位于著絲粒纖維末端，通過調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性參與有絲分裂紡錘體形成過程，影響細(xì)胞的生存。3)MCRS1蛋白通過與p53和BRG1形成與p21啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化相關(guān)的復(fù)合物參與細(xì)胞衰老過程。4)MCRS1蛋白通過細(xì)胞周期蛋白D1-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4-p21途徑調(diào)控胃癌癌細(xì)胞的增殖和凋亡。5)MCRS1具有抑癌和促癌的雙重特性，因MCRS1可抑制TEIF介導(dǎo)的hTERT轉(zhuǎn)錄，抑制端粒酶活性和細(xì)胞增殖。

綜上所述，胃癌淋巴轉(zhuǎn)移患者的胃組織存在RacGAP1與MCRS1即RacGAP1mRNA和MCRS1mRNA在組織高表達(dá)，一定程度降低了患者的生存時(shí)間。

[1]Son T,Hyung WJ.Laparoscopic gastric cancer surgery:Current evidence and future perspectives[J].World J Gastroenterol,2016,22(2):727.

[2]Lee JH,Kim JG,Jung HK,et al.Clinical Practice Guidelines for Gastric Cancer in Korea:An Evidence-Based Approach[J].J Gastric Cancer,2014,14(2):87.

[3]Liu MX,Zhou KC,Cao Y.MCRS1 overexpression,which is specifically inhibited by miR-129*,promotes the epithelial-mesenchymal transition and metastasis in non-small cell lung cancer[J].Mol Cancer,2014,13(11):2452.

[4]Li CG,Chen MX,Zhao PW,et al.Expression of MCRS1 and MCRS2 and their correlation with serum carcinoembryonic antigen in colorectal cancer[J].Exp Ther Med,2016,12(2):589.

[5]Neubauer E,Wirtz RM,Kaemmerer D,et al.Comparative evaluation of three proliferation markers,Ki-67,TOP2A,and RacGAP1,in bronchopulmonary neuroendocrine neoplasms:Issues and prospects[J].Oncotarget,2016,7(27):41959.

[6]Bornschein J,Nielitz J,Drozdov I,et al.Expression of aurora kinase A correlates with the Wnt-modulator RACGAP1 in gastric cancer[J].Cancer Med,2016，5(3):516.

[7]Jacquemet G,Morgan MR,et al.Rac1 is deactivated at integrin activation sites through an IQGAP1-filamin-A-RacGAP1 pathway[J].J Cell Sci,2013,126(18):4121.

[8]Saigusa S,Tanaka K,Mohri Y,et al.Clinical significance of RacGAP1 expression at the invasive front of gastric cancer[J].Gastric Cancer,2015,18 (1):84.

[9]Karin ML,Karn T,Müller V,et al.Validity of the proliferation markers Ki67,TOP2A,and RacGAP1 in molecular subgroups of breast cancer[J].Breast Cancer Research and Treatment,2012,137 (1):57.

[10]路 明,劉恒昌,王 權(quán).RacGAP1在胃癌中的表達(dá)與幽門螺桿菌L型感染的關(guān)系[J/OL].臨床薈萃,2016,31(01):48.

[11]陳明曉,杜金林,王建平,等.MCRS1、MCRS2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2016,38(21):1717.

[12]閆巍中.MCRS1、MCRS2在食管癌中的表達(dá)研究[J].中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理,2016,7(06):167.

[13]陳明曉,杜金林,王建平,等.MCRS1、MCRS2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2016,38(21):1717.