陳 瑞，高奕瑤，楊建增，榮小麗，王 巖

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學(xué)研究中心，吉林 長(zhǎng)春130033)

骨肉瘤是兒童和青少年多發(fā)的惡性骨腫瘤[1]，其治療主要是以手術(shù)為主，放、化療為輔，聯(lián)合化療不僅控制腫瘤細(xì)胞增殖，消除局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而且改善患者生存率[2]。然而化療中多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)的發(fā)生成為了治療的主要障礙[3]，約有40%的患者在治療初期表現(xiàn)出化療耐藥[4]。LIMK1 屬于LIM 激酶蛋白家族成員[5]，本項(xiàng)目組的前期研究發(fā)現(xiàn)LIMK1在骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞中呈高表達(dá)，同時(shí)驗(yàn)證了LIMK1對(duì)骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞耐藥及遷移具有重要的調(diào)控作用[6，7]。

本實(shí)驗(yàn)通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)驗(yàn)證了LIMK1基因表達(dá)上調(diào)對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞耐藥的影響，并通過MEM和DAVID平臺(tái)分析LIMK1及其共表達(dá)基因富集情況，進(jìn)一步探討可能的耐藥機(jī)制，為臨床防治腫瘤、開發(fā)靶向治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系及質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)的人成骨肉瘤細(xì)胞系(MG63)來自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院科學(xué)研究中心，重組質(zhì)粒CFP- LIMK1- WT cDNA由中日聯(lián)誼醫(yī)院科學(xué)研究中心王巖教授贈(zèng)送。

1.1.2主要試劑耗材及儀器 高糖 DMEM(H- DMEM)來自Gibico/USA，特級(jí)胎牛血清來自北京元亨金馬/China，Lipofectamine 2000來自Invitrogen/USA，Trizol來自Invitrogen/USA，(DL- 2000) Marker 來自北京康為/China，RT- PCR 試劑盒來自Thermo/USA，2×Taq PCR MasterMix來自TaKaRa/Japan，引物來自上海生工/China，預(yù)染 marker來自NEB/USA。CCK- 8檢測(cè)試劑盒來自Dojindo/Japan，長(zhǎng)春新堿來自上海新華聯(lián)制藥有限公司/China， CO2 孵箱來自SANYO/Japan，超凈工作臺(tái)來自VS- 1301L- U 蘇州安泰/ China。

1.1.3數(shù)據(jù)庫分析 利用基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析平臺(tái)MEM(http://biit.cs.ut.ee/mem/index.cgi)獲得LIMK1的共表達(dá)基因；通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)篩選LIMK1與其共表達(dá)基因相關(guān)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分析LIMK1可能的作用機(jī)制。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞，用含 10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋至 1×105/ml，接種于 6 孔板中，每孔300 μl，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，條件為37℃、CO2，待細(xì)胞密度達(dá)70%- 80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染采用 Lipofectamine 2000 進(jìn)行，將重組質(zhì)粒CFP- LIMK1- WT cDNA 按0 μg/ml、2.5 μg/ml、10 μg/ml三個(gè)濃度稀釋到300 μl 無血清培養(yǎng)基中；放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4- 5小時(shí)，更換成含有 10%FBS的培養(yǎng)基。所有組別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2RT- PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè) LIMK1及MDR1基因表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述細(xì)胞，用 Trizol法提取各組細(xì)胞總 RNA(濃度為1 000 ng/μl)，用Thermo 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，用TaKaRa試劑盒進(jìn)行RT- PCR檢測(cè)LIMK1及MDR1表達(dá),以β- Actin內(nèi)參進(jìn)行比較，結(jié)果用2-△△ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。所用引物見表1。

表1 引物序列

1.2.3藥物抑制率測(cè)定 將上述細(xì)胞至于96孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%- 80%時(shí)分別加入不同濃度的長(zhǎng)春新堿，以其臨床血漿峰濃度為參照設(shè)7個(gè)濃度梯度，分別為0 ng/ml、0.0625 ng/ml、0.25 ng/ml、1 ng/ml、4 ng/ml、16 ng/ml、64 ng/ml繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。更換為含10%CCK- 8 的無血清培養(yǎng)基，于孵箱內(nèi)避光培養(yǎng) 2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)，選用450 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度A值，以不含細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照組調(diào)零。抑制率公式：抑制率(%)=1-[A(陰性)-A(實(shí)驗(yàn))]/[A(陰性)]×100%，利用GraphPad Prism軟件算出長(zhǎng)春新堿對(duì)各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 IC50值。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 IC50及RT- PCR采用 GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用mean±SD表示。MEM、DAVID及實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)通過t檢驗(yàn)獲得P值，且P值<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1瞬轉(zhuǎn)后RT-PCR結(jié)果

用RT- PCR檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組中LIMK1及MDR1基因表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染濃度越高，LIMK1基因表達(dá)水平越高；同時(shí)，多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)也隨著LIMK1基因表達(dá)增強(qiáng)而增高。提示LIMK1基因表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的耐藥能力，二者呈正相關(guān)。

2.2LIMK1表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)細(xì)胞耐藥能力

根據(jù)藥物抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用抑制率公式計(jì)算抑制率；采用 GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算親本及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 IC50值。結(jié)果如表2所示，隨著轉(zhuǎn)染濃度增加，IC50值增加，二者呈正相關(guān)。

上述結(jié)果證明LIMK1表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞耐藥能力增強(qiáng)。

圖1 RT- PCR 結(jié)果。A為L(zhǎng)IMK1、MDR1及內(nèi)參β- Actin的電泳結(jié)果。B為L(zhǎng)IMK1及MDR1基因的相對(duì)表達(dá)量直方圖。

cDNA濃度(μg/ml)02.510IC50(ng/ml)1.407±0.1112.083±0.0133.443±0.083P值-0.001<0.0001

2.3LIMK1影響腫瘤耐藥可能的作用機(jī)制

通過MEM平臺(tái)搜索LIMK1基因，篩選出與其密切相關(guān)的50個(gè)共表達(dá)基因，主要包括SRC,CSF1,EFNA2,FGF6等(見下圖2)。同時(shí)通過DAVID平臺(tái)分析上述共表達(dá)基因主要的富集信號(hào)通路，結(jié)果如表3所示,表中從左往右分別為信號(hào)通路名稱、該通路中共表達(dá)基因所占百分比(%)、檢驗(yàn)富集顯著性的p值、相關(guān)聯(lián)的共表達(dá)基因名稱。與LIMK1共表達(dá)基因密切相關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路主要有Rap1 signaling pathway、TNF signaling pathway、Osteoclast differentiation、Influenza A、Calcium signaling pathway等，其中以Rap1 signaling pathway中共表達(dá)基因所占比例最高，相關(guān)性最強(qiáng)。

此外，利用Cancer Hallmarks Analytics Tool(CHAT，http://t.cn/Rp21Yxy)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)分析LIMK1在腫瘤中的主要作用，通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化逐點(diǎn)交互信息值，繪制成雷達(dá)圖。如圖3所示，圖中10個(gè)扇形分別代表了10個(gè)不同的作用，分別是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移(0.1894)、免疫破壞(-0.0340)、細(xì)胞力學(xué)(-1)、永久復(fù)制(-1)、逃避生長(zhǎng)抑制(0.0526)、基因組不穩(wěn)定和突變(0.0002)、誘導(dǎo)血管生成(0.0718)、抵抗細(xì)胞死亡(0.0208)、維持增殖信號(hào)(0.1402)、腫瘤促進(jìn)炎癥(0.0121)。其中，以腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)化逐點(diǎn)交互信息值最高，達(dá)0.1894，提示LIMK1在腫瘤中以侵襲和轉(zhuǎn)移作用為主。

圖2 LIMK1及其共表達(dá)基因熱圖。如圖所示，顏色深紅，相關(guān)性大。

KEGG_PATHWAY%P-ValueGeneRap1signalingpathway7.81.90E-02SRC,CSF1,EFNA2,FGF6TNFsignalingpathway5.93.40E-02CSF1,MAP2K7,SOCS3Osteoclastdifferentiation5.94.90E-02CSF1,MAP2K7,SOCS3InfluenzaA5.98.10E-02CREBBP,MAP2K7,SOCS3Calciumsignalingpathway5.98.60E-02ORAI2,ADRA1D,GRIN2DEpstein-Barrvirusinfection5.99.50E-02CREBBP,MAP2K7,NCOR2

圖3 LIMK1在腫瘤中主要作用的雷達(dá)圖。圖中10個(gè)扇形分別代表了10個(gè)不同的作用，十個(gè)同心圓代表標(biāo)準(zhǔn)化逐點(diǎn)交互信息值。

3 討論

腫瘤耐藥是當(dāng)前腫瘤治療與研究中面臨的首要難題[8]。雖然已有不少對(duì)腫瘤耐藥的分子機(jī)制方面的研究，比如增加藥物外排，改變藥物靶點(diǎn)，DNA損傷的修復(fù)等等[9]，但腫瘤耐藥是一個(gè)非常復(fù)雜的機(jī)制。MDR1又稱ABCB1基因，編碼P- gp蛋白，該蛋白屬于ATP- 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體，MDR1基因高表達(dá)提示細(xì)胞多藥耐藥，是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥程度的主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]。LIMK1是一種包含兩個(gè)LIM/鋅指結(jié)構(gòu)域N端的絲/蘇氨酸激酶[11]。相關(guān)研究表明，LIMK1是調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥的元素之一[12,13]。本文通過CHAT網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)分析LIMK1在腫瘤中的主要作用，發(fā)現(xiàn)LIMK1主要與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、免疫破壞、細(xì)胞力學(xué)、永久復(fù)制、逃避生長(zhǎng)抑制、基因組不穩(wěn)定和突變、誘導(dǎo)血管生成、抵抗細(xì)胞死亡、維持增殖信號(hào)、腫瘤促進(jìn)炎癥等多方面有關(guān)，其中，以腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移為主，其次為維持增殖信號(hào)、誘導(dǎo)血管生成等(圖3)。此外，還有研究證明LIMK1促進(jìn)上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT，epithelial- mesenchymal transition)，影響腫瘤患者生存率[14]。

將含有LIMK1激酶活性的重組質(zhì)粒CFP-LIMK1-WT cDNA按不同濃度梯度瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG63，發(fā)現(xiàn)上調(diào)LIMK1基因表達(dá)，細(xì)胞的耐藥能力及多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)增強(qiáng)，二者呈正相關(guān)趨勢(shì)(圖1及表2)。說明LIMK1能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的耐藥能力，其可能成為克服腫瘤耐藥的靶基因，旨在為開發(fā)新的靶向治療提供理論支撐。

DAVID是由整合的生物學(xué)知識(shí)庫和分析工具組成的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)[15]，本文應(yīng)用該平臺(tái)從LIMK1及其共表達(dá)基因中篩選出主要富集的信號(hào)通路，如Rap1 signaling pathway、TNF signaling pathway、Osteoclast differentiation、Influenza A、Calcium signaling pathway等(表3)。有研究表明在非小細(xì)胞肺癌中，RAP1-NF-κB軸對(duì)細(xì)胞增殖和耐藥有調(diào)節(jié)作用[16]，還有研究顯示TNF可以激活多藥耐藥腫瘤細(xì)胞中的新的細(xì)胞毒性通路[17]。上述信號(hào)通路為L(zhǎng)IMK1影響腫瘤耐藥的作用機(jī)制的研究提供線索和思路。

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