劉霖霖，莊傳寧，熊書晗，孟繁竹，吳秀麗

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動與環(huán)境衛(wèi)生教研室，吉林 長春130021；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室，吉林 長春130021)

糖尿病對人類健康有著嚴(yán)重危害，尋找到有效的預(yù)防治療措施已經(jīng)成為全世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究工作者的共同目標(biāo)，預(yù)計(jì)到2030年糖尿病患者將達(dá)到3.6億[1]。糖尿病的主要危險(xiǎn)因素有環(huán)境因素，遺傳因素和生活方式等。流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，有機(jī)磷農(nóng)藥的暴露接觸可以提高糖尿病的患病率與死亡率[2,3]。有機(jī)磷急性中毒的患者會出現(xiàn)短時(shí)間的尿糖并且伴有高血糖癥[4,5]，其作用機(jī)制可能是導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而引起骨骼肌胰島素信號傳導(dǎo)路徑變化。本研究選用氧樂果作為染毒劑，對大鼠持續(xù)60天的經(jīng)口染毒，檢測大鼠骨骼肌內(nèi)的PERK，BiP，p-eIF2α，eIF2α，IRE1α的表達(dá)情況，探討氧樂果對大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)對象與實(shí)驗(yàn)方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 40只8周的Wistar雄性大鼠，體重185±15 g，購于北京華阜康生物技術(shù)有限公司。

1.1.2試劑 氧樂果乳油購于江蘇華隆化工有限公司、抗體(PERK抗體、p-eIF2α抗體、IRE-α 抗體、eIF2α抗體、BiP 抗體 )購于美國CST公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物的分組與處理 將大鼠隨機(jī)分為4組，即對照組(Control)，高劑量組(HD)，中劑量組(MD)和低劑量組(LD)。每組10只，用苦味酸進(jìn)行編號。有機(jī)磷是氧樂果乳油(濃度為40%)。灌胃量為0.40 ml/Kg體重，對照組用生理鹽水灌胃，染毒組分別用不同濃度的氧樂果乳油。自由飲食、飲水，每3天對大鼠進(jìn)行稱重，并重新計(jì)算給藥量，持續(xù)2個(gè)月。

1.2.2Western Blot方法檢測蛋白表達(dá)水平 按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜后，加入一抗(PERK抗體、p-eIF2α抗體、IRE-α 抗體 、eIF2α抗體、BiP 抗體，1∶1 000稀釋)，5%脫脂牛奶封閉，室溫?fù)u床上孵育1 h后4℃過夜。洗膜后，加入二抗，1∶2 000稀釋。室溫輕搖45 min，洗膜顯影后，使用Quantity One軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1氧樂果染毒對大鼠骨骼肌中BiP表達(dá)水平的影響

染毒組BiP的表達(dá)水平均高于Control組(P<0.05)。LD組BiP的表達(dá)水平低于MD和HD組(P<0.05)；MD組BiP的表達(dá)水平低于HD組(P<0.05)。各組中BiP表達(dá)水平與比較如圖1-圖2所示。

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD；△P<0.05 vs.MD

圖2 不同染毒劑量組大鼠骨骼肌中BiP水平比較

2.2氧樂果染毒對大鼠骨骼肌中PERK表達(dá)水平的影響

染毒組PERK的表達(dá)水平均高于Control組(P<0.05)。LD組PERK的表達(dá)水平低于MD和HD組(P<0.05)；MD組PERK的表達(dá)水平低于HD組(P<0.05)。各組中PERK的表達(dá)水平與比較如圖3-圖4所示。

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD；△P<0.05 vs.MD

圖4 不同染毒劑量組大鼠骨骼肌中PERK水平比較

2.3氧樂果染毒對大鼠骨骼肌中IRE1α表達(dá)水平的影響

染毒組IRE1α的表達(dá)水平均高于Control組(P<0.05)。LD組IRE1α的表達(dá)水平低于MD和HD組(P<0.05)；MD組IRE1α的表達(dá)水平低于HD組(P<0.05)。各組中IRE1α的表達(dá)水平與比較如圖5-圖6所示。

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD；△P<0.05 vs.MD

圖6 不同染毒劑量組大鼠骨骼肌中IRE1α水平比較

2.4氧樂果染毒對大鼠骨骼肌中p-eIF2α和eIF2α表達(dá)水平的影響

經(jīng)60天染毒，檢測各組中p-eIF2α和eIF2α的表達(dá)情況。染毒組p-eIF2α和eIF2α的表達(dá)水平均高于Control組(P<0.05)。LD與MD兩組間的p-eIF2α和eIF2α表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； LD組與MD組的p-eIF2α和eIF2α的表達(dá)水平低于HD組(P<0.05)。

各組間的p-eIF2α在總eIF2α所占比例存在差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。染毒組p-eIF2α/eIF2α水平均高于Control組(P<0.05)。LD與MD組p-eIF2α/eIF2α的表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LD組和MD組p-eIF2α/eIF2α的表達(dá)水平低于HD組(P<0.05)。各組中p-eIF2α和eIF2α表達(dá)水平及比較如圖7-10所示。

3 討論

隨著社會的發(fā)展和進(jìn)步，人們生活節(jié)奏的加快，生活環(huán)境的改變以及醫(yī)療技術(shù)水平的提高，人類的疾病譜中慢性非傳染性疾病逐漸取代傳染性疾病占主導(dǎo)地位。據(jù)調(diào)查顯示全球范圍內(nèi)有將近3.5億人的健康受到糖尿病的危害。糖尿病是一種由多種原因引起的以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，其臨床表現(xiàn)為“三多一少”，即多飲，多食，多尿，消瘦。而且環(huán)境因素、遺傳因素、肥胖、營養(yǎng)因素、生理因素、社會環(huán)境因素和體力活動缺乏等都是糖尿病發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素。流行病學(xué)調(diào)查顯示長期的暴露于有機(jī)污染物可能促進(jìn)糖尿病的發(fā)生發(fā)展。有機(jī)磷和有機(jī)氯農(nóng)藥是我們?nèi)粘Ｉ钪凶畛Ｒ姾妥畛＝佑|的兩種有機(jī)污染物。有的研究推測機(jī)體產(chǎn)生的胰島素抵抗或高血糖癥可能是由于經(jīng)常暴露于大量使用有機(jī)磷的農(nóng)藥的環(huán)境所引起，關(guān)于這樣的說法有的研究者予以否認(rèn)。研究對象接觸的農(nóng)藥的種類、暴露途徑、暴露劑量不同等因素可能都會導(dǎo)致最終結(jié)果的不一致。氧樂果作為一種高毒，高效且不易產(chǎn)生抗性的有機(jī)磷農(nóng)藥，在一些發(fā)展中國家被大量使用。當(dāng)蔬菜水果中含有大量農(nóng)藥殘留，人們可因長期食用這些被污染的食物而持續(xù)暴露于有機(jī)物污染的環(huán)境中。本研究采用對大鼠持續(xù)60天的氧樂果經(jīng)口染毒，檢測骨骼肌內(nèi)的PERK，BiP，p-eIF2α，eIF2α，IRE1α的表達(dá)情況，對氧樂果對大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響和作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。

圖7 不同染毒劑量組大鼠骨骼肌中p-eIF2α和eIF2α的表達(dá)

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD

研究顯示大鼠處于有機(jī)磷暴露接觸狀態(tài)下機(jī)體可以產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在機(jī)體內(nèi)主要的功能是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白空間結(jié)構(gòu)，多肽鏈的折疊和修飾功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被打破造成蛋白發(fā)生折疊的錯(cuò)誤和障礙，細(xì)胞內(nèi)未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白的累積引起ERS[6,7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活包內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來反應(yīng)腔內(nèi)未折疊蛋白的壓力，這統(tǒng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。而且，至少三種明顯不同的UPR通路來調(diào)節(jié)各種不同基因的表達(dá)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保持穩(wěn)態(tài)或當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得不到消除時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。UPR的三條主要途徑包括PERK-eIF2α，IRE1α以及ATF6[8,9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白有IRE1α，PERK和ATF6等。BiP(GRP78)蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上一種對于維持細(xì)胞正?；钚苑浅Ｖ匾拟}離子結(jié)合分子伴侶。正常情況跨膜蛋白與分子伴侶蛋白BiP(GRP78)穩(wěn)定結(jié)合。當(dāng)網(wǎng)腔中有異常蛋白質(zhì)堆積時(shí)，或者機(jī)體受外界各種有害因素的刺激打破了細(xì)胞內(nèi)鈣平衡。與鈣離子結(jié)合的分子伴侶BiP會與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的異常蛋白結(jié)合，引起下游相應(yīng)的信號反應(yīng)。Bip對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和防止細(xì)胞凋亡具有重要作用。當(dāng)PERK與BiP分離后，PERK通路可以使eIF2α磷酸化，抑制蛋白質(zhì)的翻譯與合成。為避免異常蛋白的積聚，BiP會阻截并與其結(jié)合，還可以保證蛋白的糖基化正常進(jìn)行和促進(jìn)蛋白正確折疊，從而達(dá)到減輕ERS的目的[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，3組大鼠經(jīng)過氧樂果60天染毒后，與Control組相比，染毒組每組中BiP，PERK和IRE1α的表達(dá)水平均顯著升高，這可以證明經(jīng)過氧樂果染毒刺激后大鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生ERS反應(yīng)。到目前為止，關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥的暴露接觸能否引起機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其作用機(jī)制的研究相對較少。李蘭[11]研究發(fā)現(xiàn)用對氧磷處理的細(xì)胞也產(chǎn)生了ERS。Hajnocz-ky等[12]的研究結(jié)果也表明有機(jī)磷能夠?qū)е翬RS。

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