張倩倩，喬敏,*

1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學，北京 100049

五氯酚(pentachlorophenol, PCP)是一種含氯有機物，被廣泛用作農藥和木材防腐劑等；在我國，PCP及其鈉鹽常被用于殺滅血吸蟲的中間宿主——釘螺，以防治血吸蟲病[1]。PCP的廣泛使用，引起了嚴重的污染問題，在水、沉積物和土壤等環(huán)境介質中以及一些生物體內都有檢出[1-4]。PCP具有致癌性、免疫毒性、神經毒性、生殖毒性和內分泌干擾效應等[5-6]。目前，對PCP毒理效應的研究主要集中在大鼠、斑馬魚、大型溞等生物上[5, 7-8]，對土壤無脊椎動物的研究較少。

在土壤生態(tài)毒理學的研究中，跳蟲是一種常用的模式生物[9]。跳蟲的存活率、繁殖和回避行為等指標，可被用于指示污染物的毒性[10-11]。Crouau等[11]研究了PCP對跳蟲的繁殖毒性，在暴露時間為33～34 d時，繁殖抑制EC50為87 mg·kg-1。此外，跳蟲分子水平上的指標，也越來越多地被用于生態(tài)毒理學的研究中[12-15]。與存活率、繁殖等毒性終點相比，分子水平上的指標一般更敏感，反應更快。

細胞色素P450(Cytochrome P450, CYP450)和谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione-S Transferase, GST)等是常用的分子生物標志物。CYP450和GST都是代謝轉化酶，CYP450是一相代謝酶，GST是二相代謝酶，它們在外源物質的代謝和解毒方面起重要作用[13-14, 16-17]。 有研究報道，菲能誘導跳蟲CYP450和GST基因的表達[13-14]。PCP能被人的CYP450 3A4轉化為四氯對苯二酚[18]；四氯對苯二酚能消耗谷胱甘肽，造成氧化損傷[19]。在PCP降解菌中，PCP被氧化為四氯對苯二酚后，會被GST轉化為2,6-二氯對苯二酚，再經其他氧化還原酶作用轉化為3-氧代己二酸[20]。

內分泌干擾物能影響生物的內分泌系統(tǒng)，從而影響生物的生長、發(fā)育和繁殖等。已有一些研究表明PCP具有內分泌干擾效應[5-6, 21-22]，但少有PCP對土壤無脊椎動物內分泌干擾效應的研究。跳蟲作為一種節(jié)肢動物，在其整個生命過程中持續(xù)蛻皮[23]。節(jié)肢動物的蛻皮是由激素控制的，目前對節(jié)肢動物蛻皮過程已有一些研究，發(fā)現(xiàn)一些蛻皮相關基因，但對跳蟲蛻皮相關基因表達的研究很少，內分泌干擾物暴露下跳蟲蛻皮相關基因表達變化更鮮有報道。

本文以人工土壤為暴露介質，研究了不同濃度PCP暴露下，跳蟲蛻皮相關基因、CYP450和GST基因表達水平的變化，以期為PCP等內分泌干擾物的生態(tài)毒性和生態(tài)風險評價提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

供試生物為白符跳(Folsomiacandida)，來自挪威國家農業(yè)與環(huán)境研究所(Bioforsk)，在本實驗室持續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方法如下：跳蟲飼養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，底部有0.5 cm厚的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由熟石膏、活性炭和蒸餾水(質量比為9:1:7)混合后制成。培養(yǎng)皿放在人工氣候箱(寧波江南RXZ-380D)中，控制溫度為(20±1) ℃，濕度為(70%±5%)，黑暗培養(yǎng)。每周補充蒸餾水以保持培養(yǎng)基濕潤，并加入少量干酵母作為跳蟲食物。實驗中選用的跳蟲需經過同齡化培養(yǎng)，同齡化方法如下：挑選50～60只活躍成蟲至新培養(yǎng)基中，加入少量干酵母，待成蟲產卵(約2 d)后，移去成蟲，每天觀察，當觀察到有幼蟲孵出后，將幼蟲轉移到新培養(yǎng)基中培養(yǎng)。跳蟲培養(yǎng)到23 d大時即可用于實驗。

主要試劑為PCP(純度98%，ULTRA scientific, USA)和丙酮(色譜純，F(xiàn)isher Chemical, USA)，石英砂(Sigma-Aldrich)，高嶺土(化學純，滬試)，泥炭(德國Klasmann泥炭土876型)等。

1.2 暴露方法

本實驗中的暴露介質為人工土壤，配制方法為：將泥炭、高嶺土和石英砂按照1:2:7的質量比混合均勻，用CaCO3調節(jié)pH至(6.0±0.5)。配制不同濃度的PCP的丙酮溶液，加入到人工土壤中，攪拌混合均勻，使各處理組中PCP濃度分別為0、30、60、120和240 mg·kg-1干土，每個處理組做3個重復。加入一定量蒸餾水調節(jié)土壤含水量至土壤最大持水量的50%，分裝至100 mL燒杯中(每個燒杯放入30 g濕土)。每個燒杯中加入30只23 d大的跳蟲，用封口膜將燒杯封口，2 d后，用水浮法取出跳蟲，放入離心管中，用液氮速凍后轉入-80 ℃冰箱儲存。

1.3 基因表達水平測定

跳蟲RNA的提取利用微量樣品總RNA提取試劑盒(天根)，操作按試劑盒的說明書進行。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA的完整性，利用Nanodrop測定RNA濃度，提取的RNA的OD260/OD280值在1.8～2.1范圍內。利用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根)進行反轉錄，然后將各個cDNA樣本稀釋10倍備用。定量PCR反應在iCycle IQ2(Bio-rad, USA)儀器上進行，使用SuperRealPreMix Plus試劑盒(天根)。反應體系為20 μL，包括：10 μL的2×SuperReal PreMix Plus，2 μL的cDNA模板，6.8 μL的ddH2O，正向引物和反向引物各0.6 μL。反應條件為：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s并采集熒光信號，40個循環(huán)；并設置溶解曲線以檢測擴增產物的特異性?；虮磉_水平采用2-ΔΔCT法計算[24]。

待測的基因及其引物如表1所示。部分基因的引物序列來自于已發(fā)表文獻。對于基因Fcc04073和Fcc01306，根據其EST序列，利用Beacon Designer 8設計引物。對新設計的引物進行PCR反應，使用2×Taq PCR MasterMix(天根)，反應體系為50 μL，包括：25 μL的2×Taq PCR MasterMix，5 μL的cDNA模板，16 μL的ddH2O，正向引物和反向引物各2 μL。反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物經切膠純化后，進行TA克隆，再進行測序，測序結果與目的基因片段比對后確認為需要的目的基因。各對引物qPCR擴增效率利用標準曲線法測定，從各個cDNA樣本中取出一部分混合作為模板，進行5倍梯度稀釋，共5個梯度。

1.4 數據處理

在數據滿足(或經數據轉換后滿足)正態(tài)性(Shapiro-Wilk檢驗)和方差齊性(Levene檢驗)的前提下，進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，利用Dunnett's t 檢驗進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。若數據不滿足正態(tài)性和方差齊性，則利用Kruskal-Wallis單因素方差分析。數據分析和繪圖利用SPSS 20.0和Origin 8.5完成。

2 結果(Results)

表1 qPCR中各個基因的引物Table 1 Primers used in the qPCR analysis

注：a根據Blastx和interPro注釋結果，獲得基因功能；bFcc02512(YWHAZ)被用作內參基因。

Note：aFunction is derived from the annotation results of Blastx and interPro;bFcc02512(YWHAZ) is used as reference gene.

圖1 PCP暴露對跳蟲基因表達的影響(“*”)指該處理組與對照組相比差異顯著，P<0.05)Fig. 1 Effects of PCP on gene expression of F. candida (“*”) denotes significant difference between treated and control groups, P<0.05)

PCP對跳蟲的CYP450、GST基因和蛻皮相關基因的表達水平的影響如圖1所示。CYP450基因Fcc01651、Fcc02155和Fcc03650的表達水平和PCP暴露濃度之間的效應-劑量關系不顯著(P>0.05)。隨著PCP濃度的增加，F(xiàn)cc01651的表達水平先上下波動，后有逐漸增加的趨勢；Fcc02155的表達水平先增加，后上下波動；Fcc03650的表達水平整體上呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢；但這些變化都不顯著(P>0.05)。

跳蟲GST基因Fcc04073和Fcc05260的表達水平與PCP暴露濃度之間的效應-劑量關系不顯著(P>0.05)。在PCP濃度較高時，F(xiàn)cc04073(120 mg·kg-1)和Fcc05260(120 mg·kg-1和240 mg·kg-1)的表達水平高于對照組，但并不顯著(P>0.05)。在PCP濃度為30、60和120 mg·kg-1時，F(xiàn)cc00494的表達水平與對照組相近；在PCP濃度為240 mg·kg-1時，GST基因Fcc00494的表達受到顯著誘導(P<0.05)，為對照組的2.18倍。

在PCP濃度為30 mg·kg-1和60 mg·kg-1時，幾丁質酶基因Fcc00881的表達水平略有降低；在PCP濃度為120 mg·kg-1和240 mg·kg-1時，F(xiàn)cc00881的表達受到顯著抑制，分別為對照組的40.95%和28.89%(P<0.05)。隨著PCP濃度的增加，幾丁質結合蛋白基因Fcc01306的表達水平逐漸下降；在PCP濃度為120 mg·kg-1和240 mg·kg-1時，F(xiàn)cc01306的表達受到顯著抑制，分別為對照組的13.11%和4.20%(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

CYP450是一相代謝酶，它是一類含血紅素的依賴NADPH的單加氧酶，催化許多物質的氧化代謝[29]。菲暴露2 d和7 d均發(fā)現(xiàn)能顯著誘導跳蟲CYP450基因的表達[13-14]。在本實驗條件下，跳蟲CYP450基因Fcc01651、Fcc02155和Fcc03650并未受到PCP的顯著影響?；虮磉_會受暴露時間等的影響，本實驗的暴露時間為2 d，這些CYP450基因的表達未發(fā)生顯著變化，可能因為暴露時間較短。

GST是二相代謝酶，它廣泛存在于各種好氧生物體內，在抗氧化、外源物質的代謝和解毒方面起著重要的作用[30]。GST可以通過促進還原脫氯化氫作用或與還原性谷胱甘肽的結合反應，將疏水性的有毒物質轉化為具有親水性的物質，從而更易于排出體外；此外，在有毒物質的代謝過程中可能產生氧自由基，GST在氧自由基的去除過程中起重要作用[31]。有研究報道，Cd[32]、吡蟲啉[12]和菲[13-14]等顯著誘導了跳蟲GST基因的表達。PCP能對背角無齒蚌(Anodontawoodiana)產生氧化脅迫，誘導GST基因的表達[33-34]。本研究結果表明，PCP顯著誘導了跳蟲GST基因Fcc00494的表達，可能是因為GST參與了PCP的代謝，或者PCP引發(fā)了氧自由基的產生，GST參與了氧自由基的去除。跳蟲GST基因Fcc04073和Fcc05260有被PCP誘導表達的趨勢，但并不顯著(P>0.05)，PCP對不同跳蟲GST基因(Fcc00494、Fcc04073和Fcc05260)作用不同，這可能是因為不同GST之間存在著差異，具有不同的特異性和親和性[30-31]。Nota等[13]利用基因芯片研究菲暴露下跳蟲基因表達譜的變化，實驗結果顯示，在暴露于濃度為24.95 mg·kg-1(干土)的菲時，跳蟲GST基因Fcc00494、Fcc04073和Fcc05260都顯著上調，但上調的程度不同。

蛻皮是跳蟲重要的生命過程，影響著跳蟲的生長和繁殖。跳蟲在其一生中持續(xù)蛻皮，每次蛻皮會更新其表皮和中腸上皮，圍食膜是中腸上皮的一部分[35-38]。跳蟲表皮和圍食膜的主要成分是幾丁質和蛋白質[35-37, 39]。幾丁質酶在蛻皮過程中起著降解幾丁質的作用[40]。有研究報道，在干旱脅迫下，跳蟲停止蛻皮，幾丁質酶基因Fcc00881的表達顯著下調，在補水后，跳蟲恢復蛻皮，幾丁質酶基因Fcc00881的表達顯著上調[28]。幾丁質結合域是一些圍食膜蛋白質和幾丁質酶的組成部分[41-44]。本研究結果表明，PCP顯著抑制了跳蟲幾丁質酶基因Fcc00881和幾丁質結合域基因Fcc01306的表達，說明PCP可能抑制了跳蟲的蛻皮。已有報道表明PCP對水生節(jié)肢動物大型溞(Daphniamagna)的蛻皮有抑制作用[7]，且雌二醇、乙烯雌酚和4-壬基酚等內分泌干擾物也會抑制大型溞的蛻皮[45]。蛻皮又主要是由蛻皮激素調控的，PCP對蛻皮的抑制可能是通過干擾蛻皮激素進行調控。有研究表明，PCP 能誘導搖蚊(Chironomusriparius)蛻皮激素受體基因和蛻皮激素應答基因E74的表達[46]。

近期，跳蟲的基因組信息進一步完善，從中找到與蛻皮激素緊密相關的基因(如蛻皮激素受體基因)，研究PCP暴露下這些基因的表達變化，將能進一步闡明PCP對跳蟲內分泌系統(tǒng)的影響。生物體內含有多種CYP450和GST，找到跳蟲其他的CYP450和GST基因開展相關研究，將能進一步了解PCP對跳蟲代謝轉化酶的影響。此外，基因表達會隨著時間的變化而變化，而且不同基因的響應速度不同，本實驗的暴露時間為2 d，測定不同時間暴露下的基因表達，將能進一步了解PCP對跳蟲基因表達的影響。自然土壤和人工土壤的性質存在著差異，而土壤性質能影響污染物的毒性，本實驗使用的土壤是人工土壤，應進一步對具有代表性的自然土壤開展相關研究。

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