張麗萍，劉文君

清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100084

隨著環(huán)境污染的持續(xù)加劇，我國飲用水源和飲用水水質(zhì)不可避免地受到影響。飲用水水質(zhì)對人類健康的長期影響，特別是遺傳毒性和致癌作用，越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。許多研究表明，飲用水中的化學(xué)污染物能夠增加某些腫瘤的發(fā)生，引起生物繁殖力的降低以及后代畸形的增加[1-4]。

自20世紀(jì)80年代將Ames試驗用于飲用水以及水處理工藝出水的遺傳毒性評價。在眾多的遺傳毒性短期試驗方法中，Ames試驗最為常用[4-5]。

用Ames試驗評價濃縮水樣的遺傳毒性時，最常用的做法是采用TA98、TA100 2個測試菌株，分別在加或不加體外哺乳動物肝微粒體酶活化系統(tǒng)(簡稱S9)的條件下進(jìn)行試驗，每組試驗采用至少3個不同劑量。雖然Ames試驗的優(yōu)點之一是操作簡單[4]，但由于水源水、飲用水中有機(jī)物含量甚微，需要濃縮非常高的倍數(shù)才能達(dá)到Ames試驗的檢測靈敏度。通常需要富集幾十升、上百升，甚至更多的水樣，耗時長，工作量大。樣品制備過程的繁瑣成為制約Ames試驗廣泛應(yīng)用的重要原因[5]。

為了研究工作的方便，國內(nèi)外研究者希望簡化Ames試驗方法，在盡量不影響檢測靈敏度的情況下，減少Ames試驗的工作量和樣品使用量。國內(nèi)有研究者采用TA98、TA100 2個測試菌株不加S9的簡化方法[6-7]，甚至有研究者采用更為簡化的TA98一個測試菌株不加S9的方法[8,22,30]。國外研究者除采用TA98、TA100 2個測試菌株不加S9的簡化方法外，還有采用TA98測試菌株加或不加S9的簡化方法[9-10]。還有研究者將Ames試驗由3個以上劑量梯度簡化為只用一個劑量的點試驗方法[11]。

不同地區(qū)水中的有機(jī)污染物質(zhì)種類不同，對Ames試驗測試體系的敏感度有差異。為了探討適合我國水質(zhì)的Ames試驗簡化方法，作者查閱了1985～2017年期間，我國研究者在科技期刊公開發(fā)表的用Ames試驗評價我國水源水、水處理工藝出水及飲用水遺傳毒性的相關(guān)文獻(xiàn)80多篇，文獻(xiàn)主要來自《中國知網(wǎng)》數(shù)據(jù)庫，少量來自國外英文期刊[12-13]。擯棄其中Ames試驗數(shù)據(jù)不詳以及相同數(shù)據(jù)重復(fù)發(fā)布的文章，最終選擇52篇文章進(jìn)行Ames試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，共涉及480個水樣(包括水源水、水處理工藝出水和自來水)，共計1 645個測試數(shù)據(jù)。根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析總結(jié)，作者提出了Ames試驗在評價我國飲用水相關(guān)水樣時的最佳簡化方法。

1 Ames試驗測試體系(Testing systems of Ames test)

Ames試驗通常采用帶有不同突變基因的一套菌株進(jìn)行測試。根據(jù)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水中有機(jī)物質(zhì)一般對TA98和TA100 2種試驗菌株比較敏感，所以在測試飲用水時，Ames試驗通常采用TA98和TA100 2種試驗菌株[6]。另外，在Ames試驗中，還采用體外哺乳動物肝微粒體酶系統(tǒng)(S9)來檢測需要經(jīng)體內(nèi)代謝活化才呈現(xiàn)為致突變性的間接致突變物。因此，在評價水的遺傳毒性時，常用的Ames試驗通常包括4個測試體系：TA98-S9、TA98+S9、TA100-S9和TA100+S9，分別用來鑒定樣品的直接移碼型致突變性、間接移碼型致突變性、直接堿基置換型致突變性和間接堿基置換型致突變性。

Ames試驗測定水樣遺傳毒性時，樣品對任何一個測試體系結(jié)果呈陽性反應(yīng)，那么就判定該樣品為致突變陽性。陽性結(jié)果通常以單位水樣的致突變活性的高低來衡量遺傳毒性的強(qiáng)弱。使用多個測試體系是為了防止樣品致突變性的漏檢。樣品獲得陽性的測試體系數(shù)量與樣品的遺傳毒性強(qiáng)弱沒有直接關(guān)系。如果多個測試體系呈現(xiàn)陽性，以陽性最強(qiáng)的結(jié)果表征該水樣的遺傳毒性的強(qiáng)弱[6]。因此，如果能確定陽性最強(qiáng)的測試體系，則可以只使用一個測試體系，其他測試體系則可以省略，這也是尋求Ames試驗簡化方法的依據(jù)。

在采用Ames試驗方法的52篇文獻(xiàn)中，共涉及480個不同水樣，統(tǒng)計結(jié)果列于表1。

從表1可以看出，在4個測試體系中，TA98-S9是使用率最高的。除1篇文獻(xiàn)中4個樣品只采用TA98+S9和TA100+S9測試體系以外[14]，其他51篇文獻(xiàn)中，所有476個樣品均采用TA98-S9測試體系。TA100-S9測試體系的使用率略低于TA98-S9測試體系，因為少數(shù)研究中，對部分水樣簡化為只用TA98-S9進(jìn)行測試。TA98+S9和TA100+S9測試體系的使用率相近，低于不加S9的2個體系[8,22,30]。

在被統(tǒng)計文獻(xiàn)中，共有38篇文獻(xiàn)采用了上述4個測試體系對全部或部分水樣進(jìn)行Ames試驗，除3篇文獻(xiàn)未列出測試結(jié)果因而無法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析外[60-62]，其余35篇文獻(xiàn)中289個水樣列出了4個體系的全部測試結(jié)果，這部分?jǐn)?shù)據(jù)被用于對不同測試體系進(jìn)行比較，按文獻(xiàn)發(fā)表時間順序列于表2。其他14篇文獻(xiàn)只采用了2個測試體系，甚至1個測試體系[7, 14, 27-30, 37-44]。將表2的結(jié)果整理計算后可得表3結(jié)果。

表1 Ames試驗不同測試體系的使用情況Table 1 The use of different testing systems of Ames test

注：a文章使用率為在被調(diào)查文獻(xiàn)中使用了該測試體系的文章數(shù)量占被調(diào)查文章總數(shù)量的百分比；b樣品使用率為在被調(diào)查文獻(xiàn)中使用了該測試體系的樣品數(shù)量占被測試樣品總數(shù)量的百分比。

Notes： a, usage rate by papers is the percentage ratio of the number of papers using this testing system to the total number of papers investigated; b, usage rate by samples is the percentage ratio of the number of samples using this testing system to the total number of samples in the investigated papers.

表2 使用4個測試體系的Ames試驗測試結(jié)果Table 2 Testing results of Ames test using 4 testing systems

注：*最強(qiáng)陽性數(shù)為該測試體系測得陽性結(jié)果中致突變活性高于其他3個測試體系的數(shù)據(jù)數(shù)量；**額外陽性數(shù)為該測試體系測得最強(qiáng)陽性結(jié)果并且該樣品用TA98-S9體系測試結(jié)果為陰性的數(shù)據(jù)數(shù)量。

Notes：*Number of maximum positive results is the number of positive results by this testing system whose mutagenic activity is stronger than those by the other three testing systems;**Number of extra positive results is the number of results that this testing system has the maximum positive result when TA98-S9 testing system has negative result.

從表3可以看出，TA98-S9測試體系的陽性率高達(dá)69%，TA98+S9測試體系的陽性率次之，達(dá)60%，而TA100-S9和TA100+S9測試體系的陽性率分別為22%和16%，說明水樣對TA98菌株比對TA100菌株更敏感，而且在不加S9時，最為敏感。這與國內(nèi)很多研究結(jié)論相一致[17,26,34]。

表2所列35篇文獻(xiàn)中，涉及采用4個測試體系的289個樣品，其中220個樣品為陽性，69個樣品為陰性。TA98-S9測試體系的陽性檢出率和陰性可信度都是最高的，即陽性樣品用TA98-S9測試體系測出陽性結(jié)果的概率高達(dá)91%，而其測出陰性結(jié)果的樣品中有78%為真陰性，證明該測試體系的定性結(jié)果可信度很高。TA98+S9測試體系也具有較高的定性結(jié)果可信度。而TA100-S9、TA100+S9測試體系的陽性檢出率和陰性可信度僅有20%～30%，證明其定性結(jié)果的可信度不高。

從最強(qiáng)陽性率的統(tǒng)計結(jié)果來看，4個測試體系的最強(qiáng)陽性率分別為66%、29%、4%、1%，亦即在陽性樣品的定量評價中，TA98-S9測試體系的貢獻(xiàn)率為66%，TA98+S9測試體系的貢獻(xiàn)率為29%，TA100-S9、TA100+S9 2個測試體系對測定陽性樣品的實際致突變性強(qiáng)度幾乎沒有貢獻(xiàn)。

有效數(shù)據(jù)率表征該測試體系的測試結(jié)果在定量測定中的可信度，是定量試驗中最值得關(guān)注的參數(shù)。采用TA98-S9體系，測得215個樣品的致突變活性不低于其他3個測試體系的結(jié)果，即單獨采用TA98-S9測試體系的有效數(shù)據(jù)率可以達(dá)到74%，顯著高于其他3個測試體系。采用TA98+S9測試體系檢出174個陽性樣品，但是測得的致突變性普遍弱于TA98-S9體系，只有63個陽性樣品測得的致突變性強(qiáng)于其他3個測試體系(包括8個額外陽性結(jié)果)，有效數(shù)據(jù)率約為46%。TA100-S9測試體系是使用率僅次于TA98-S9的測試體系，但是，采用TA100-S9測試體系只檢出9個樣品的致突變性強(qiáng)于TA98-S9體系(包括7個額外陽性結(jié)果)，即單獨用TA100-S9體系僅可獲得27%的有效數(shù)據(jù)率，有效數(shù)據(jù)主要來源于陰性水樣，對測試結(jié)果的意義不大。至于TA100+S9測試體系，僅有2個樣品測得的致突變活性強(qiáng)于其他3個測試體系[17,31](包括1個額外陽性結(jié)果[31])，對樣品測試結(jié)果的影響幾乎可以忽略不計。事實上，在35篇列出了TA100+S9體系測試數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)中，有25篇文章的測試結(jié)果全部為陰性。

從以上統(tǒng)計結(jié)果可以看出，在用Ames試驗評價我國飲用水相關(guān)樣品的遺傳毒性時，TA98-S9測試體系最為敏感，也最為可靠，是定性、定量試驗中都應(yīng)該優(yōu)先選用的測試體系，在已有研究中的應(yīng)用也是最多的；TA98+S9測試體系的靈敏度和可靠性僅次于TA98-S9測試體系，在定性、定量試驗中對TA98-S9測試體系可起到補(bǔ)充作用；陽性檢出率和有效數(shù)據(jù)率僅次于TA98-S9，顯著高于實際應(yīng)用頻率更高的TA100-S9測試體系，TA100-S9與TA100+S9 2個測試體系對Ames試驗結(jié)果的影響幾乎可以忽略。

導(dǎo)致上述結(jié)果的原因可以歸為2個方面：一方面是因為TA98測試菌株比TA100更為敏感。單獨使用TA98可檢出83%的致突變物，將TA100和TA98結(jié)合使用可檢出93%的致突變物[6]。另一方面的原因跟水中污染物的特性有關(guān)，一般認(rèn)為水中致突變物以直接致突變物居多，并且氯化消毒過程增加直接致突變物，而在加入S9活化系統(tǒng)時其敏感性通常降低[6]。受不同工、農(nóng)業(yè)污染以及不同水處理藥劑的影響，不同地區(qū)的水源水和飲用水中的污染物種類有所不同，表現(xiàn)出的遺傳毒性特征也可能有差別。一項針對全世界不同國家和地區(qū)地表水遺傳毒性的文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)[36]，TA98-S9、TA98+S9測試體系的陽性率皆為15%，TA100-S9、TA100+S9測試體系的陽性率皆為7%。與之對比可以發(fā)現(xiàn)，雖然TA98菌株比TA100菌株更敏感的結(jié)論是一致的，但我國水源水和飲用水相關(guān)樣品表現(xiàn)出明顯的特異性，TA98比TA100的陽性率高更多，而且加S9活化系統(tǒng)后敏感度降低。這也是建立適合我國飲用水特性的簡化Ames試驗方法的依據(jù)。

表3 Ames試驗不同測試體系的測試結(jié)果對比Table 3 Comparison on the results of different testing systems of Ames test

注：1陽性率為該測試體系測出的陽性結(jié)果數(shù)占共測樣品數(shù)(289個)的百分比，表征該測試體系對樣品的敏感程度；2陽性檢出率為該測試體系測出的陽性結(jié)果數(shù)占陽性結(jié)果總數(shù)(220個)的百分比，代表陽性樣品用該體系測出陽性結(jié)果的概率，表征該測試體系陽性結(jié)果的定性可信度；3陰性可信度為陰性樣品數(shù)(69個，用4個測試體系測得結(jié)果全部為陰性的樣品數(shù)量)占該測試體系測出的陰性結(jié)果數(shù)的百分比，代表用該體系測出陰性結(jié)果而實際樣品為陰性的概率；4有效數(shù)據(jù)數(shù)為該測試體系測得結(jié)果中致突變活性不低于其他3個測試體系的數(shù)據(jù)數(shù)量(陰性結(jié)果的致突變活性視為零)，即該測試體系的最強(qiáng)陽性數(shù)加陰性樣品總數(shù)(69個)；5有效數(shù)據(jù)率為該測試體系有效數(shù)據(jù)數(shù)占共測樣品數(shù)(289個)的百分比，表征該測試體系的測試結(jié)果在定量測定中的可信度。

Notes： 1 Positive rate is the percentage ratio of the number of this testing system’s positive results to the number of shared samples (which is 289), which shows this testing system’s sensitivity on samples; 2 Positive detection rate is the percentage ratio of the number of this testing system’s positive results to the total number of positive results (which is 220), which means the probability of positive samples be detected as positive results by this testing system, and shows the qualitative reliability of this testing system’s positive results; 3 Reliability of negative results is the percentage ratio of the total number of negative samples (the number of samples that were detected as negative by all four testing systems, which is 69) to the number of this testing system’s negative results, which shows the probability of real negative results when detected as negative by this testing system; 4 Number of effective results is the number of this testing system’s results whose mutagenic activity is not lower than the other three testing systems (the mutagenic activity of negative sample is considered as zero), which equals the sum of the number of this testing system’s maximum positive results and the total number of negative samples (which is 69); 5 Effective rate of results is the percentage ratio of the number of this testing system’s effective results to the total number of shared samples (which is 289), which shows the quantitative reliability of this testing system’s results.

2 Ames試驗方法(Ames test methods)

文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，不同的測試者在研究中采用的Ames試驗方法有所不同，有的采用了4個測試體系，有的只采用了2個測試體系，有的甚至只采用一個測試體系。我們將只采用TA98-S9測試體系的Ames試驗方法稱為方法1；將采用TA98-S9、TA98+S9 2種測試體系的方法稱為方法2；將采用TA98-S9、TA100-S9 2種測試體系的方法稱為方法3；將同時采用4種測試體系的方法稱為方法4。從水樣富集和Ames試驗工作量來看，方法1的工作量最小；方法2和方法3的工作量次之，是方法1的2倍；方法4的工作量最大，是方法2和方法3的2倍，是方法1的4倍。

方法4是我國研究者采用Ames試驗評價飲用水和水源水致突變性時最廣泛使用的方法，與美國《水和廢水監(jiān)測分析方法》第20版中推薦的Ames試驗方法相同。根據(jù)統(tǒng)計，52篇文獻(xiàn)中有38篇使用了方法4，占文獻(xiàn)總數(shù)的71%[8, 12-13, 15-26, 31-35, 45-62]。

有些測試單位認(rèn)為水中的致突變物以直接致突變物為主，因此Ames試驗僅采用TA98-S9和TA100-S9測試體系(方法3)[7, 27-30, 37-44]。采用方法3的文獻(xiàn)有13篇，占被統(tǒng)計文獻(xiàn)的25%；未發(fā)現(xiàn)只使用方法1的文獻(xiàn)報道，僅在使用方法4的文獻(xiàn)中有2篇[8,22]，方法3的論文中有1篇[30]對部分水樣使用了方法1；方法2在國內(nèi)被統(tǒng)計文獻(xiàn)中未見報道，有國外研究者使用的報道[9-10]；另有1篇文獻(xiàn)采用TA98+S9和TA100+S9 2種測試體系[14]。通過上述文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果可以看出，試驗菌株經(jīng)體外代謝活化后，水樣的致突變活性通常降低，不能確切反映水樣的遺傳毒性，因此只使用加S9測試體系的方法不科學(xué)，在此不作討論。

圖1 4種方法的陽性檢出率Fig. 1 Positive detection rate of 4 methods

圖2 4種方法的有效數(shù)據(jù)率Fig. 2 Effective rate of 4 methods

以方法4的致突變陽性檢出率和有效數(shù)據(jù)率作為100%，根據(jù)表2的文獻(xiàn)統(tǒng)計結(jié)果，可以計算出各文獻(xiàn)中Ames試驗如果分別采用4種方法的陽性檢出率和有效數(shù)據(jù)率。如圖1、圖2所示，各圖的最右側(cè)一個數(shù)據(jù)代表35篇文獻(xiàn)的匯總結(jié)果。從圖中可以看出，只使用TA98-S9測試體系的方法1在大部分文獻(xiàn)數(shù)據(jù)中可以獲得較高的陽性檢出率，匯總陽性檢出率高達(dá)91%。在方法1基礎(chǔ)上增加測試體系的方法2、方法3陽性檢出率更高，但4種方法的匯總陽性檢出率差別不大。因此，如果只定性評價水樣的致突變陰、陽性而不關(guān)注致突變性的相對大小，推薦選用工作量最小的方法1，平均可獲得91%的陽性檢出率。

如果對水樣的致突變性進(jìn)行定量評價，需要考察Ames試驗方法的有效數(shù)據(jù)率。從圖2可以看出，4種方法的有效數(shù)據(jù)率順序為方法4>方法2>方法3>方法1。雖然方法4的有效數(shù)據(jù)率最高，也是最為常用的Ames試驗方法，但是其耗費的工作量和水樣量也是最大的，成為限制Ames試驗方法廣泛應(yīng)用的主要原因，這也是研究者試圖尋求簡化方法的原因。方法1僅用25%的工作量，即可獲得74%的有效數(shù)據(jù)率，是非常經(jīng)濟(jì)而有效的方法。方法2和方法3的工作量相當(dāng)，是方法4工作量的50%，但是方法2的有效數(shù)據(jù)率顯著大于方法3，方法2的匯總有效數(shù)據(jù)率高達(dá)96%，而方法3僅為78%。與方法1相比，方法2增加TA98+S9測試體系使有效數(shù)據(jù)率提高了22%，而方法3增加TA100-S9測試體系僅使有效數(shù)據(jù)率提高了4%，說明TA100-S9測試體系對我國飲用水相關(guān)水樣中的遺傳毒性物質(zhì)不敏感。

通過上述統(tǒng)計對比可以發(fā)現(xiàn)，雖然方法2未見文獻(xiàn)報道，但與此前最常見的Ames試驗簡化方法3相比，有效數(shù)據(jù)率具有顯著優(yōu)勢，用方法4一半的工作量即可獲得96%的有效數(shù)據(jù)率，是用Ames試驗評價我國飲用水相關(guān)水樣遺傳毒性時最合適的簡化方法。在僅進(jìn)行致突變性定性評價時，或者在測試費用、時間、水樣量等條件受限制的條件下，推薦使用方法1，用25%的工作量可獲得92%的陽性檢出率和74%的有效數(shù)據(jù)率。

3 結(jié)論及建議(Conclusions and suggestions)

從國內(nèi)研究者30多年來的試驗結(jié)果可以得出，在用Ames試驗評價我國飲用水相關(guān)樣品的致突變性時，TA98-S9測試體系的敏感度和可靠度最高，TA98+S9次之，TA100-S9與TA100+S9 2個測試體系對Ames試驗結(jié)果的影響幾乎可以忽略。雖然使用TA98-S9、TA98+S9、TA100-S9、TA100+S9 4個測試體系的方法4是使用率最高和最可靠的Ames試驗方法，也是美國《水和廢水監(jiān)測分析方法》中推薦的方法，但是該方法實驗工作量大，樣品制備、委托測試的費用不菲，不利于Ames試驗的廣泛推廣應(yīng)用。作者建議，研究者在用Ames試驗評價我國飲用水、水源水以及給水處理工藝出水的致突變性時，可以使用TA98-S9、TA98+S9 2種測試體系的方法2，僅需50%的工作量，即可獲得96%的陽性檢出率和96%的有效數(shù)據(jù)率，適合廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和日常水質(zhì)評價。采用TA98-S9測試體系的方法1僅用25%的工作量，可以獲得91%的陽性檢出率和74%的有效數(shù)據(jù)率，適合用于定性評價水樣的致突變性，或者在測試費用、時間、水樣量等條件有限的情況下也可用于定量評價。

致謝：感謝中國疾病預(yù)防與控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所徐鳳丹老師對論文工作的悉心指導(dǎo)！感謝清華大學(xué)孫文俊博士幫忙校對文稿！

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