沈子又 張超 董彬 付建新 胡紹慶 趙宏波

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，臨安 311300；2. 浙江理工大學(xué)建筑工程學(xué)院，杭州 310018）

類胡蘿卜素是由異戊二烯骨架構(gòu)成的C40或C30萜類化合物，是一類重要的天然色素的總稱，在可見光下呈紅色、橙色或黃色［1］，是果實(shí)和花的重要呈色物質(zhì)之一。番茄紅素環(huán)化是類胡蘿卜素代謝中的一個(gè)重要分支點(diǎn)，植物中存在兩種番茄紅素環(huán)化酶（LCYB和LCYE）。LCYB能對稱地催化番茄紅素兩端各生成1個(gè)β環(huán)，只有一端被環(huán)化時(shí)，生成γ-胡蘿卜素，另一端進(jìn)一步被環(huán)化后則生成β-胡蘿卜素；LCYE僅能催化番茄紅素的一端生成ε環(huán)，即δ-胡蘿卜素，另一端再由LCYB進(jìn)一步催化生成α-胡蘿卜素［2］。氨基酸序列分析表明擬南芥中的LCYB和LCYE同源性為36%，可能有共同的起源［3］。LCYB和LCYE基因表達(dá)的相對水平?jīng)Q定了下游由β-胡蘿卜素代謝生成的β-隱黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、新黃質(zhì)以及由α-胡蘿卜素代謝生成的α-隱黃質(zhì)和葉黃素等在類胡蘿卜素總量中的比例［4-5］。果實(shí)中有大量的類胡蘿卜素積累，目前克隆出的LCYB和LCYE基因大多為果實(shí)和作物中分離出來的。在番茄果實(shí)中克隆得到番茄紅素 -β-環(huán)化酶 -CrtL-b（LCYB）［6］、番茄紅素 -ε-環(huán)化酶 -CrtL-e（LCYE）［7］；玉米中克隆和鑒定的LCYB和LCYE基因［8-9］；甘薯中分離出了 LCYE 基因［10］和 LCYB 基因等［11］。

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）隸屬于木犀科木犀屬（Osmanthus），是我國十大傳統(tǒng)名花之一，也是重要的園林綠化樹種。根據(jù)開花特性不同，可分為秋桂和四季桂，秋桂品種按照花色不同又分為金桂品種群（黃色至金黃色系）、銀桂品種群（黃白色至黃色系）和丹桂品種群（橙色至橙紅色系）［12］。桂花花瓣中含有類黃酮化合物和類胡蘿卜素兩大類色素成分，在黃酮類化合物形成基本淺黃色系的基礎(chǔ)上，決定不同品種間花色變化的主要成分是類胡蘿卜素，且類胡蘿卜素種類及其含量的變化決定不同品種花色的差異［13］。前期研究發(fā)現(xiàn)，OfLCYB1、OfLCYE1等基因的差異表達(dá)決定了類胡蘿卜素代謝分支下游產(chǎn)物的含量。本研究克隆OfLCYB和OfLCYE基因啟動子序列，分析順式作用元件，構(gòu)建其植物表達(dá)載體并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析，以期為明確OfLCYB和OfLCYE基因參與類胡蘿卜素代謝及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為6-8年生的丹桂品種‘堰虹桂’（Osmanthus fragrans ‘Yanhong Gui’），種植于浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃。

DNA限制性內(nèi)切酶、LA Taq酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA marker ladder）、T4-DNA連接酶、克隆載體pMD18-T、大腸桿菌感受態(tài)DH5α以及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒、In-Fusion HD Cloning Kit、XbaI和Hind Ⅲ等均購自TaKaRa公司，染色用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽）購于上海生工，pBI121由本實(shí)驗(yàn)室保存，其他常規(guī)試劑采用進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 桂花啟動子的克隆及序列分析 基因組DNA的提取采用CTAB法［14］。根據(jù)‘堰虹桂’LCYB和LCYE基因序列設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。用限制性內(nèi)切酶DraI、StuI、Pvu II和EcoR V分別對桂花基因組DNA進(jìn)行酶切并連接接頭，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第二輪反應(yīng)模板為第一輪反應(yīng)產(chǎn)物1 μL與49 μL ddH2O混合產(chǎn)物。50 μLPCR 反應(yīng)體系為 ：模板 DNA 1 μL，AP1/AP2 1 μL，GSP1/GSP2 1 μL，10×La PCR buffer 5 μL，dNTP 5 μL，Mg2+3.75 μL，LA Taq 1 μL，ddH2O 32.5 μL。第一輪PCR反應(yīng)條件為：94℃ 25 s，72℃ 3 min，7個(gè)循環(huán)；94℃ 25 s，67℃ 3 min，32個(gè)循環(huán)；67℃ 7 min。第二輪PCR反應(yīng)條件為：94℃ 25 s，72℃ 3 min，5 個(gè)循環(huán) ；94℃ 25 s，67℃ 3 min，20個(gè)循環(huán)；67℃，7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切下目的條帶，使用凝膠回收試劑盒回收并純化。將純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種到含Amp（50 mg/L）的LB平板上37℃培養(yǎng)14-16 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR，測序。用Plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子序列結(jié)果進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。

表1 啟動子克隆相關(guān)引物序列

1.2.2 OfLCYB和OfLCYE啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)上述研究中克隆出的OfLCYB和OfLCYE啟動子設(shè)計(jì)引物（表2），使用In-Fusion HD Cloning Kit進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建。表達(dá)載體pBI121用XbaI和 Hind Ⅲ雙酶切，10 μL連接體系為2 μL 5× In-Fusion HD Enzyme Premix，2 μL pBI121 純化產(chǎn)物，6 μL目的片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落搖菌后進(jìn)行PCR檢測，測序。

表2 啟動子表達(dá)載體相關(guān)引物

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化與瞬時(shí)表達(dá) 制備農(nóng)桿菌感受態(tài)，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中［15］，將煙草葉片剪成切成0.5 cm×0.5 cm的葉塊，在農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.6的侵染液中浸染10 min，用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將侵染的外植體移至于無菌水浸潤的濾紙上培養(yǎng)24 h并進(jìn)行GUS染色，37℃下保溫16-24 h。用乙酸∶乙醇（3∶1）的混合液脫色后取出觀察染色結(jié)果［16］。

2 結(jié)果

2.1 OfLCYB和OfLCYE啟動子的克隆

以‘堰虹桂’基因組DNA為模板通過兩輪PCR擴(kuò)增分別獲得OfLCYB和OfLCYE啟動子片段大約1 kb和900 bp（圖1）。將此片段回收，與pMD18-T載體連接，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，證明該啟動子片段已克隆到pMD18-T載體上。陽性克隆測序結(jié)果表明，OfLCYB序列長度為1 028 bp，OfLCYE序列長度904 bp。

2.2 OfLCYB和OfLCYE啟動子的序列分析

通過Plantcare對OfLCYB和OfLCYE啟動子進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，OfLCYB啟動子在起始密碼子上游-156 bp處發(fā)現(xiàn)核心元件TATA-box，且多處發(fā)現(xiàn)CAAT-box，同時(shí)還有光響應(yīng)元件ACE、Box 4、GATT-motif、Sp1，脫落酸響應(yīng)元件ABRE，赤霉素響應(yīng)元件P-box，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件5' UTR Py-rich stretch，參與晝夜控制的順式作用調(diào)節(jié)元件circadian，MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS以及防御和應(yīng)激反應(yīng)中的元件TC-rich repeats等（圖2）。OfLCYE啟動子中TATA-box位于起始密碼子上游-295 bp處，同時(shí)還有兩個(gè)光響應(yīng)元件AE-box、G-box，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，熱擊響應(yīng)元件HSE，參與蛋白代謝調(diào)節(jié)的順式調(diào)控原件O2-site，厭氧誘導(dǎo)必需的調(diào)控元件ARE，胚乳表達(dá)所需的調(diào)控元件Skn-1_motif等（圖 3）。

圖1 ‘堰虹桂’OfLCYB（A）和OfLCYE（B）啟動子擴(kuò)增圖譜

2.3 OfLCYB和OfLCYE啟動子的瞬時(shí)表達(dá)分析

構(gòu)建OfLCYB和OfLCYE啟動子表達(dá)載體經(jīng)菌落PCR鑒定準(zhǔn)確無誤后命名為PBI121-LCYB、PBI121-LCYE。以煙草的葉為受體材料，以含pBI121載體的菌株為陽性對照，以GV3101空菌株為陰性對照，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法對OfLCYB和OfLCYE啟動子表達(dá)特性進(jìn)行分析。圖4顯示，在農(nóng)桿菌侵染后的煙草葉片中除了GV3101外均檢測到GUS基因的產(chǎn)物，表明所克隆的桂花基因OfLCYB和OfLCYE啟動子序列具有啟動子功能，同時(shí)也表明這兩個(gè)啟動子均具有驅(qū)動下游GUS報(bào)告基因表達(dá)的能力。但由圖中結(jié)果可以看出，OfLCYB啟動子驅(qū)動報(bào)告基因在煙草葉片中只是少量表達(dá)（圖4-C）。

圖2 OfLCYB啟動子中相關(guān)順式作用元件預(yù)測分析

3 討論

目前在花中LCYB和LCYE基因已從菊花（Chrysanthemum moriflium）［17］、黃花龍膽（Gentiana lutea）［5］、金花茶（Camellia nitidissima）［18］、鶴望蘭（Strelitzia reginae）［19］等植物中分離出來。‘堰虹桂’花瓣中的類胡蘿卜素主要為α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。對類胡蘿卜素合成途徑中的相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，在鈴梗期到初開期的過程中OfLCYE表達(dá)量上升，到盛開期下降［20］。

植物啟動子在調(diào)控基因表達(dá)過程中起關(guān)鍵作用，關(guān)于LCYB和LCYE啟動子的研究較少，目前僅在番茄（Solanum habrochaites）［21］、杧 果（Mangifera indica）［22］、西瓜（Citrullus lanatus）［23］等作物上有報(bào)道。李靜［24］在研究黃瓜和西瓜基因組中類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的比較分析中將3種葫蘆科植物的LCYB和LCYE啟動子序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)LCYB的啟動子序列是高度保守的，而LCYE啟動子序列不同物種間會有一段序列的插入或缺失，但這并不是造成番茄紅素積累差異的原因。柑橘CsLCYb1啟動子長度為1 584 bp，含有大量激素響應(yīng)元件如赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif、水楊酸響應(yīng)元件the TCA motif和生長素響應(yīng)元件TGA motif等，并通過相應(yīng)的激素誘導(dǎo)說明其能提高CsLCYb1啟動子活性［25］。外源GA3處理抑制番茄成熟過程中各部位類胡蘿卜素和番茄紅素含量，對β-胡蘿卜素含量的影響表現(xiàn)為先抑制后促進(jìn)的作用；外源ABA處理増加了番茄果實(shí)中類胡蘿素和β-胡蘿卜素的含量［26］。OfLCYB和OfLCYE啟動子都具有多個(gè)激素響應(yīng)元件。OfLCYB啟動子中包含一個(gè)脫落酸響應(yīng)元件ABRE，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element和一個(gè)赤霉素響應(yīng)元件P-box；OfLCYE啟動子中包含一個(gè)赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif和3個(gè)水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，推測這兩個(gè)啟動子的轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)該受到ABA、赤霉素和水楊酸等激素的影響。有研究表明植物基因5'UTR區(qū)對基因的表達(dá)調(diào)控起著重要作用［27］，水稻中的5' UTR的內(nèi)含子可使rubi3的轉(zhuǎn)錄水平大幅度提升［28］。在OfLCYB啟動子-585 bp處有一個(gè)5' UTR區(qū)，可能對該基因的表達(dá)起重要的調(diào)控作用。在OfLCYB啟動子-896 bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)MYB的結(jié)合位點(diǎn)MBS，推測MYB也可能對LCYB的表達(dá)起調(diào)控作用。OfLCYE啟動子-520 bp處含有一個(gè)熱激響應(yīng)元件HSE，表明該基因表達(dá)可能受溫度調(diào)控。除此之外，OfLCYB和OfLCYE啟動子含有多個(gè)不同類型的光響應(yīng)元件，如ACE、Box 4、GATT-motif、Sp1、AE-box和G-box，推測OfLCYB和OfLCYE啟動子的表達(dá)可能受光信號的調(diào)控。在不同的光周期和不同的光質(zhì)條件下，越桔（Vaccinium myrtillus L.）果實(shí)中包括LCYB和LCYE在內(nèi)的類胡蘿卜素代謝途徑中的相關(guān)基因表達(dá)水平不同，說明光照對LCYB和LCYE的表達(dá)可能有一定的影響［29］。

圖3 OfLCYE啟動子中相關(guān)順式作用元件預(yù)測分析

圖4 OfLCYB和OfLCYE啟動子瞬時(shí)表達(dá)檢測

瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明OfLCYB和OfLCYE啟動子可以驅(qū)動GUS基因在煙草葉片中的表達(dá)，但OfLCYB啟動子驅(qū)動基因表達(dá)較少，這可能是由于OfLCYB啟動子活性較低或具有組織表達(dá)特異性所致。前期研究發(fā)現(xiàn)在不同溫度處理下‘堰虹桂’OfLCYB和OfLCYE的表達(dá)量隨溫度變化有明顯變化，尤其是OfLCYB基因。本研究對OfLCYB和OfLCYE啟動子中的元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)僅OfLCYE啟動子中含與溫度相關(guān)的元件HSE，而OfLCYB啟動子中大多數(shù)為激素相關(guān)元件。在用25 mg/L和50 mg/L的水楊酸對紅潮球菌（Haematococcus pluvialis）進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)包括LCY基因在內(nèi)的部分類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平得到明顯提高［30］。因此推測在桂花中這些激素先與溫度相互作用，而后進(jìn)一步共同調(diào)控基因的表達(dá)。相關(guān)結(jié)果有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)克隆了桂花番茄紅素環(huán)化酶基因OfLCYB和OfLCYE啟動子，并通過瞬時(shí)表達(dá)分析證明了這兩個(gè)啟動子具有活性。這兩個(gè)啟動子都含有一些水楊酸、赤霉素等激素響應(yīng)元件，推測對這兩個(gè)基因的表達(dá)起了一定作用。

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