陳坤 袁飛燕 柴昊男 劉煥 王興吉 張會(huì)圖 路福平

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 山東隆科特酶制劑有限公司，沂水 276400）

蛋白酶是一類能夠催化水解肽鍵的酶，在食品、環(huán)境、醫(yī)藥等各類領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值［1-2］，主導(dǎo)全球工業(yè)酶市場［3］。堿性蛋白酶（Alkaline protease）是一類最適pH值偏堿性的蛋白酶，在食品、洗滌以及皮革等行業(yè)有著廣泛的用途［4-5］。堿性蛋白酶強(qiáng)的水解、耐熱及耐堿能力［6］，使其一直以來備受人類研究的關(guān)注。

由于堿性蛋白酶的廣泛用途以及產(chǎn)酶效率不高等原因，一直以來市場都處于供不應(yīng)求的現(xiàn)狀［7］。目前，國內(nèi)外對于微生物堿性蛋白酶的研究主要側(cè)重于菌種選育、酶轉(zhuǎn)譯及調(diào)控機(jī)制的研究等方面［8-9］，而對于提高生產(chǎn)菌產(chǎn)酶能力和酶的性質(zhì)的研究較少。近年來，越來越多的研究者開始將注意力轉(zhuǎn)向通過生物技術(shù)和蛋白質(zhì)手段構(gòu)建堿性蛋白酶高產(chǎn)工程菌等方面［10］。

枯草芽孢桿菌由于其無致病性、安全、無明顯密碼子偏嗜性、代謝產(chǎn)物分離純化簡便等優(yōu)點(diǎn)［11-12］，被廣泛作為酶與抗生素等的表達(dá)宿主應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。另一方面，枯草芽孢桿菌高效表達(dá)元件嚴(yán)重匱乏、遺傳轉(zhuǎn)化效率低和分泌系統(tǒng)較弱等問題［13-14］，同時(shí)也限制了其應(yīng)用價(jià)值。

在微生物遺傳系統(tǒng)中，啟動(dòng)子具有十分重要的作用，選用強(qiáng)啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的表達(dá)是提高基因異源表達(dá)非常有效的方法［15］。從地衣芽孢桿菌中篩選獲得一種新型的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，以兩種堿性蛋白酶基因?yàn)閳?bào)告基因，研究其在枯草芽孢桿菌WB600中的表達(dá)強(qiáng)度，以期構(gòu)建堿性蛋白酶高效表達(dá)系統(tǒng)，并為枯草芽孢桿菌異源基因的表達(dá)提供新型調(diào)控元件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 枯草芽孢桿菌（B.subtilis）WB600、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）11965和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pUBA110均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase均購自TaKaRa公司；GeneRuler 1 kb DNA Ladder、Pierce Unstained Protein MW Marker 購自Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA切膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；福林酚、酪蛋白底物、三氯乙酸等購自Sangon Biotech（Shanghai）公司。

種子培養(yǎng)基（肉湯培養(yǎng)基）：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，初始pH值為7.2-7.4；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米粉6.4%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.03%，高溫淀粉酶0.07%（防止糊化）。

枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備培養(yǎng)基：（1）SP-A Salts Solution ：（NH4）2SO40.4%，K2HPO4·3H2O 2.8%，KH2PO41.2%，Trisodium Citrate Dihydrate 0.2% ；（2）SP-B Salts Solution ：MgSO4·7H2O 0.04% ；（3）100×CAYE Solution ：Casamino acid 2%，Yeast Extract 10% ；（4）SPI Medium（20 mL）：SP-A Salts Solution 9.8 mL，SP-B Salts Solution 9.8 mL，50% Glucose 200 μL，100×CAYE 200 μL ；（5）SPII Medium（6 mL）：SPI Medium 5.88 mL，50 mmol/L CaCl260 μL，250 mmol/L MgCl260 μL ；（6）100×EGTA Solution：10 mmol/L EGTA溶液，溶解時(shí)加入少量NaOH至pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 地衣芽孢桿菌啟動(dòng)子篩選 由本實(shí)驗(yàn)室菌種保藏庫中接種地衣芽孢桿菌11965于無抗LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落于新的LB平板三區(qū)劃線進(jìn)行活化，12 h后挑取單菌落于50 mL種子培養(yǎng)基中，220 r/min過夜培養(yǎng)，分別接取2 mL種子培養(yǎng)液于3個(gè)裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔8 h進(jìn)行取樣，離心收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，切取最亮的條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)譜檢測。

1.2.2 啟動(dòng)子及信號肽片段的克隆 蛋白質(zhì)譜結(jié)果顯示該酶為地衣芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶（Chitinase），由NCBI數(shù)據(jù)庫獲取其基因序列，通過在線軟件Promoter 2.0 Prediction Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）和SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析其啟動(dòng)子和信號肽。Degering等［16］的研究表明源于地衣芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶的信號肽dBli00338使蛋白酶subtilisin BPN'分泌表達(dá)量提高了6-7倍，因此選用dBli00338代替報(bào)告基因自身信號肽。通過引物pChi-F和SP-R（表1），以地衣芽孢桿菌11965基因組為模板，PCR擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶啟動(dòng)子和信號肽片段。PCR反應(yīng)體系為：無菌雙蒸水 33.8 μL，10×Pyrobest Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）5 μL，上游引物和下游引物各2 μL，基因組模板2 μL，Pyrobest DNA聚合酶0.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收PCR產(chǎn)物。

表1 引物及核苷酸序列

選用啟動(dòng)子pShuttle-09和pyxiE為對照，驗(yàn)證pChi的表達(dá)強(qiáng)度。啟動(dòng)子pShuttle-09和pyxiE分別通過引物pS-F/pS-R和pY-F/pY-R（表1）經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，并與引物SP-F/SP-R擴(kuò)增的信號肽dBli00338片段通過重疊PCR技術(shù)進(jìn)行連接。

1.2.3 兩種堿性蛋白酶成熟肽基因的克隆 報(bào)告基因所用的兩種堿性蛋白酶基因分別為克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因alk（GenBank Sequence ID：FJ940727.1）和地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因apr（GenBank Sequence ID：AY590140.1）。根據(jù)編碼基因序列，運(yùn)用在線分析軟件SignalP 4.1 Server分析得到兩種蛋白酶基因的成熟肽序列，并設(shè)計(jì)PCR引物alk-F/alk-R和apr-F/apr-R（表1）。

1.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物切膠回收后獲得的啟動(dòng)子-信號肽片段與報(bào)告基因成熟肽片段分別使用Bam HI酶切后連接，連接產(chǎn)物純化后使用Sac II和Xho I雙酶切并切膠回收，通過T4 DNA連接酶克隆到pUBA110表達(dá)載體上，連接反應(yīng)體系為（10 μL）：pUBA110載體片段3 μL，啟動(dòng)子-信號肽-報(bào)告基因片段 5 μL，10×T4 DNA Buffer 1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，16℃連接6 h，連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.5 枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化

（1）挑取新活化的枯草芽孢桿菌WB600單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，過夜培養(yǎng)；（2）取100 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至5 mL SPI培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長末期OD600=1.2（約3-4 h）；（3）取200 μL生長至對數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 mL SPII培養(yǎng)基中，37℃，100 r/min 培養(yǎng) 1.5 h；（4）在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μL 10 mmol/L EGTA，37℃，100 r/min培養(yǎng)10 min；（5）加入連接產(chǎn)物，37℃，100 r/min培養(yǎng)30 min；（6）調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至220 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，取菌液涂布于含有50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB篩選平板，37℃培養(yǎng)12 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為pCalk110、pCapr110、pSalk110、pSapr110、pYalk110 和pYapr110，所對應(yīng)的重組菌命名為C1、C2、S1、S2、Y1和 Y2。

1.2.6 蛋白酶粗酶液的制備及分析 將新鮮平板上的6株菌的單菌落分別接入50 mL Kan抗性種子培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，分別檢測菌株種子液的OD600，以相同的接種量轉(zhuǎn)接于含有Kan抗性的裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的擋板瓶中，每株菌做3個(gè)平行，于37℃、220 r/min發(fā)酵培養(yǎng)，每隔6 h收集發(fā)酵液，4℃、12 000 r/min離心取上清，用于SDS-PAGE分析和酶活測定。SDS-PAGE分析取用20 μL發(fā)酵上清液與5 μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer混合均勻，沸水浴10 min后上樣10 μL。

堿性蛋白酶酶活測定參照GB/T 23527-2009［17］附錄B福林酚法進(jìn)行，1個(gè)酶活力單位（U/mL）定義為1 mL酶液在40℃、pH10.5條件下反應(yīng)1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量。

2 結(jié)果

2.1 地衣芽孢桿菌啟動(dòng)子篩選

對地衣芽孢桿菌11965進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別取24 h，32 h，40 h，48 h的發(fā)酵上清液，使用12% 的蛋白分離膠檢測，如圖1所示，分子量大小為60 kD左右的胞外蛋白表達(dá)量最高。切取48 h該酶的蛋白電泳條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)譜檢測，如圖2為對該蛋白多肽鏈打斷后不同出峰時(shí)間的元素豐度。對各出峰時(shí)間肽鏈進(jìn)行蛋白質(zhì)二級質(zhì)譜，結(jié)果如表2，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，初步確定該酶為地衣芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶（Chitinase）。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

含有不同啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組表達(dá)載體構(gòu)建過程見圖3。通過PCR擴(kuò)增及DNA切膠回收，成功獲得5條基因片段，分別為399 bp的pChidBli0338，314 bp的pShuttle-09-dBli0338，248 bp的pyxiE-dBli0338，1 062 bp的克勞氏堿性蛋白酶基因alk成熟肽和1 053 bp的地衣堿性蛋白酶基因apr成熟肽，以及通過Sac II-XhoI雙酶切并切膠回收獲得的3 729 bp的pUBA110載體片段（圖4），大小均與預(yù)期相符。重組載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入WB600感受態(tài)，通過Kan抗性平板篩選，分別挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行驗(yàn)證并由北京華大基因科技有限公司測序，測序分析與實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致，證明報(bào)告基因和啟動(dòng)子-信號肽片段成功克隆到載體pUBA110上，重組表達(dá)載體pCalk110、pCapr110、pSalk110、pSapr110、pYalk110和pYapr110及所對應(yīng)的重組菌C1、C2、S1、S2、Y1和Y2構(gòu)建成功。

圖1 地衣芽孢桿菌11965發(fā)酵上清蛋白電泳

圖2 斷裂的目的蛋白不同出峰時(shí)間的元素豐度

表2 目的蛋白各肽段的總二級質(zhì)譜結(jié)果

圖3 含有不同啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建

圖4 重組載體各片段的PCR擴(kuò)增及pUBA110的酶切回收

2.3 發(fā)酵上清液的SDS-PAGE檢測

分別取C1、S1、Y1、C2、S2和Y2六株菌48 h的發(fā)酵上清液通過1.5 mL，10 K的超濾柱濃縮后進(jìn)行蛋白電泳檢測。SDS-PAGE結(jié)果（圖5）顯示，6株菌均有一條清晰的條帶，且與目標(biāo)蛋白分子量大小38.8 kD和31.3 kD相一致，表明在3種啟動(dòng)子的調(diào)控下，兩種堿性蛋白酶報(bào)告基因均成功表達(dá)。

2.4 不同啟動(dòng)子對兩種堿性蛋白酶基因表達(dá)強(qiáng)度的影響

測定不同時(shí)間發(fā)酵上清液中堿性蛋白酶的酶活，每組實(shí)驗(yàn)作3個(gè)平行，通過SPSS（Statistical Product and Service Solutions）軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并檢測其顯著性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由x-±s表示。如圖6，發(fā)酵培養(yǎng)48 h時(shí)，各重組菌發(fā)酵上清液中堿性蛋白酶活性達(dá)到最高。篩選得到的啟動(dòng)子pChi對兩種報(bào)告基因的啟動(dòng)強(qiáng)度明顯高于另外兩個(gè)啟動(dòng)子，發(fā)酵48 h時(shí)，pChi、pShuttle-09、pyxiE表達(dá)克勞氏堿性蛋白酶的活性分別為（8027.55±230.84）U/mL、（7124.62±295.48）U/mL、（5268.28±196.49）U/mL（P= 5.49×10-4＜ 0.01），表達(dá)地衣堿性蛋白酶的活性分別為（3545.42±146.97）U/mL、（2638.91±106.72）U/mL、（1472.78±89.65）U/mL（P= 6.74×10-6＜ 0.01）。結(jié)果表明，pChi的啟動(dòng)強(qiáng)度是pShuttle-09的1.25倍，pyxiE的2倍，該結(jié)果與蛋白電泳初步檢測的結(jié)果相一致。

2.5 啟動(dòng)子pChi結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

通過在線分析軟件BPROM對篩選所獲得啟動(dòng)子pChi進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析，結(jié)果如圖7。pChi具有原核啟動(dòng)子典型的保守序列-35區(qū)（TTGTCT）和-10區(qū)（TATTAG），被σA因子識(shí)別，間隔為16 bp。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（+1）與-10區(qū)之間的間隔為6 bp，核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD，AGGAGA）距離幾丁質(zhì)酶基因的起始密碼子（GTG）8 bp。

圖5 重組菌的蛋白電泳檢測

3 討論

Yang等［18］利用啟動(dòng)子誘捕技術(shù)由地衣芽孢桿菌中篩選的啟動(dòng)子pShuttle-09表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到P43的8倍，pShuttle-09為雜合啟動(dòng)子，含有兩對典型的保守序列，均被σA因子識(shí)別，分別為相距18 bp的-35區(qū)（TTGACG）和-10區(qū)（TATTAT），相距19 bp的-35區(qū)（CTGAAA）和-10區(qū)（TATAAT）。SD（GAGAGG）距離基因luxS的起始密碼子（ATG）4 bp。Zhang等［19］由枯草芽孢桿菌篩選獲得的啟動(dòng)子pyxiE表達(dá)強(qiáng)度也高于P43，pyxiE含有間隔為20 bp的-35區(qū)（TTGACA）和-10區(qū)（AATAAA），轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（+1）與-10區(qū)間隔為7 bp，典型的SD序列（AGGCGG）距離基因yxiE的起始密碼子（ATG）7 bp。

圖6 六株重組菌的產(chǎn)酶曲線

圖7 啟動(dòng)子pChi結(jié)構(gòu)分析

啟動(dòng)子的啟動(dòng)強(qiáng)度主要取決于啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)，一般來說，兩保守區(qū)序列-35區(qū)和-10區(qū)間隔為17 bp或18 bp時(shí)啟動(dòng)活性最強(qiáng)，而RBS結(jié)合位點(diǎn)與起始密碼子之間的距離也是決定啟動(dòng)子強(qiáng)度的關(guān)鍵因 素，通 常 為 10 bp［20］。pChi、pShuttle-09、pyxiE三個(gè)啟動(dòng)子的保守序列均被σA因子識(shí)別，pChi和pShuttle-09兩保守區(qū)之間間隔為16 bp和18 bp，但pyxiE為20 bp，這可能是造成pyxiE的啟動(dòng)活性遠(yuǎn)低于其它兩種啟動(dòng)子的主要原因。而pChi和pShuttle-09中SD與起始密碼子分別相距8 bp、4 bp，這可能是pChi表達(dá)活性高于pShuttle-09的原因之一。

4 結(jié)論

由地衣芽孢桿菌基因組中篩選獲得一種新型組成型啟動(dòng)子，以克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶和地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因?yàn)閳?bào)告基因，對其表達(dá)活性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，啟動(dòng)子pChi的表達(dá)強(qiáng)度是pShuttle-09的1.25倍，pyxiE的2倍，從而為介導(dǎo)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中異源基因的高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。另一方面，構(gòu)建了堿性蛋白酶高效表達(dá)工程菌，實(shí)現(xiàn)了堿性蛋白酶的高效分泌表達(dá)，推動(dòng)堿性蛋白酶的基因工程改造進(jìn)程以及工業(yè)化生產(chǎn)。

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