楊潔，董建，李運(yùn)，史國輝

（1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北 唐山 063000）

腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）多發(fā)生于休克、腎移植、腎動(dòng)脈重建、心肺復(fù)蘇等，常常引起急性腎損傷，甚至導(dǎo)致急性腎功能衰竭[1]?？寡趸瘧?yīng)激、減輕炎癥損傷的機(jī)制在缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图芭R床急性腎損傷過程中發(fā)揮重要作用，因此，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)在抗氧化應(yīng)激的能力和抑制炎癥因子表達(dá)、降低腎組織缺血和破壞的程度是缺血性腎損傷的預(yù)防性措施之一。

苦碟子為菊科苦賣菜屬植物，具有清熱解毒、活血化瘀、排膿止痛之功效?？嗟幼⑸湟菏峭ㄟ^提取苦碟子中腺嘌呤核苷、黃酮類、生物堿等有效成分精制而成。已有文獻(xiàn)[2-3]報(bào)道，苦碟子對(duì)心和腦的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。但是，苦碟子注射液對(duì)IRI的效應(yīng)及可能機(jī)制尚不清楚，本文通過復(fù)制腎臟缺血再灌注模型，觀察苦碟子注射液對(duì)IRI的影響并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡健康雄性SD大鼠18只（華北理工大學(xué)動(dòng)物中心提供），清潔級(jí)，體重230～270 g，飼料為華北理工大學(xué)動(dòng)物中心提供的鈷60滅菌飼料。

1.2 試劑與儀器

苦碟子注射液（悅安欣）20 ml/支（沈陽雙鼎制藥有限公司，批號(hào)：Z20025449），IL-6兔抗大鼠多克隆抗體（購自中杉金橋生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（均購自南京建成生物工程研究所），大鼠細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。Benckman全自動(dòng)生化儀（美國貝克曼庫爾特公司），Olympus顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 分組與給藥

將健康雄性SD大鼠18只隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（IRI組）、苦碟子干預(yù)組（KDZ組），每組6只。KDZ組于術(shù)前72、48、24和1 h給予苦碟子注射液（按8 ml/kg）腹腔注射共4次，其余兩組同時(shí)間腹腔注射等容量生理鹽水。

1.4 手術(shù)方法

術(shù)前12 h禁食水，常規(guī)備皮、消毒，10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，Sham組僅沿腹正中線開腹切除右腎，游離左側(cè)腎臟，分離腎蒂但不夾閉，暴露45 min后關(guān)腹。IRI組、KDZ組手術(shù)操作同Sham組，僅在切除右腎和游離左腎之后，夾閉左腎動(dòng)脈45 min后恢復(fù)血流灌注，以撤除血管夾后5 min內(nèi)腎臟顏色由暗紫色轉(zhuǎn)為紅色為復(fù)制模型成功。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

以上3組均在持續(xù)再灌注24 h后留取血標(biāo)本及腎組織標(biāo)本。取左腎后縱行切開，冷PBS液沖洗，一半置于10%多聚甲醛液中固定，另一半冰上稱重后制備10%組織勻漿，離心（4 000 r/min）15 min取上清，-80℃冰箱保存；下腔靜脈采血2 ml于真空采血管內(nèi)，靜置30 min后離心（3 000 r/min，15 min），留取血清于-80℃冰箱保存。

采用Benckman全自動(dòng)生化儀測(cè)定各組大鼠腎功能指標(biāo)血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）；腎組織石蠟包埋后切片（4μm），進(jìn)行HE染色，Olympus顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變；采用免疫組織化學(xué)法（PV法）觀察白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）在大鼠腎組織內(nèi)的表達(dá)情況；采用SOD、MDA試劑盒分別檢測(cè)血漿總SOD、MDA的活性水平；ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)腎組織中ICAM-1含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，在組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下，再采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較；非正態(tài)分布以中位數(shù)和4分位數(shù)間距[M（P25-P75）]表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦碟子注射液對(duì)腎功能的影響

經(jīng)H檢驗(yàn)，Scr、BUN水平3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均χ2=15.158，P=0.001）（見表1）。根據(jù)平均秩次進(jìn)一步推斷，IRI組Scr和BUN水平最高，KDZ組次之，Sham組最低，表明腎臟IRI模型復(fù)制成功。

2.2 苦碟子注射液對(duì)腎組織病理形態(tài)變化的影響

經(jīng)過常規(guī)脫蠟至水、蘇木素染色、酒精分化、自來水藍(lán)化、伊紅染色、梯度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片等過程，光鏡下觀察各組大鼠腎組織HE染色顯示，Sham組大鼠腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，管腔內(nèi)僅有少量上皮細(xì)胞脫落，間質(zhì)內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤；與Sham組相比，IRI組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，管腔縮小甚或堵塞，其內(nèi)可見脫落細(xì)胞和管型，間質(zhì)水腫明顯，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；KDZ組腎小管上皮細(xì)胞變性不明顯，管腔內(nèi)可見少量上皮細(xì)胞和管型，間質(zhì)輕度水腫，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，病理損傷程度輕于IRI組。見圖1。

表1 苦碟子注射液對(duì)缺血再灌注大鼠Scr和BUN含量的影響 [n =6，M（P25-P75）]

圖1 各組大鼠腎組織HE染色比較 （×40）

2.3 苦碟子注射液對(duì)腎組織IL-6表達(dá)的影響

經(jīng)過高壓修復(fù)抗原、3% H2O2孵育、滴加一抗（1∶200）過夜、二抗37℃溫育、DAB顯色、蘇木素染色等過程，并以PBS溶液替代一抗做陰性對(duì)照，觀察免疫組織化學(xué)結(jié)果，陽性結(jié)果為棕黃色顆粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6主要表達(dá)于皮髓質(zhì)交界區(qū)腎小管上皮細(xì)胞胞漿，腎小球著色為陰性。Sham組少量IL-6表達(dá)，IRI組IL-6表達(dá)量較Sham組增多，KDZ組表達(dá)量較IRI組減少。見圖2。

2.4 苦碟子注射液對(duì)腎組織中SOD活力、MDA含量變化的影響

分別用羥胺法與硫代巴比妥酸法檢測(cè)腎組織中SOD活力、MDA含量。經(jīng)單因素方差分析，SOD活力、MDA含量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=84.877和15.415，均P=0.000），其中IRI組腎組織中SOD活力低于Sham組（t=-13.259，P=0.000），MDA含量高于Sham組（t=5.413，P=0.000）；而KDZ組SOD活力較IRI組升高（t=5.872，P=0.000），MDA含量較IRI組降低（t=-3.005，P=0.013）。見表 2。

圖2 各組大鼠腎組織IL-6表達(dá)比較 （×40）

表2 苦碟子注射液對(duì)腎組織勻漿中SOD和MDA含量影響 （n =6，±s）

表2 苦碟子注射液對(duì)腎組織勻漿中SOD和MDA含量影響 （n =6，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與IRI組比較，P ＜0.05

Sham 組 76.83±3.38 5.32±1.05 IRI組 48.67±4.001） 9.51±1.581）

2.5 苦碟子注射液對(duì)缺血再灌注大鼠腎組織勻漿中ICAM-1的影響

Sham組ICAM-1為（116.44±19.71）ng/L，IRI組（304.31±38.02）ng/L，KDZ 組（195.00±31.91）ng/L。經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.192，P=0.000），與Sham組比較，IRI組的含量升高（t=10.747，P=0.000），和IRI組比較，KDZ組的含量降低（t=-5.395，P=0.000）。見圖 3。

圖3 苦碟子注射液對(duì)大鼠腎組織勻漿ICAM-1含量的影響

3 討論

腎臟是血液供應(yīng)較豐富的器官，當(dāng)遭受手術(shù)、外傷、休克等刺激時(shí)，常常發(fā)生缺血再灌注損傷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性腎功能衰竭，主要病理過程為腎細(xì)胞遭受缺血及復(fù)灌過程激活并釋放過量炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生大量氧自由基，對(duì)腎臟造成二次打擊，從而加重腎臟損傷[4]。隨著IRI愈發(fā)頻繁，其發(fā)病機(jī)制及防治愈加引發(fā)人們關(guān)注，因此，針對(duì)缺血再灌注的早期治療具有重要價(jià)值。

苦碟子注射液是提取苦碟子有效成分，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)精制而成，主要含有腺苷、黃酮類，具有擴(kuò)張血管、減少炎癥介質(zhì)、改善微循環(huán)、平衡氧與能量代謝等作用?？嗟幼⑸湟号R床應(yīng)用廣泛，除了用于心腦血管外，還用于糖尿病腎病、糖尿病周圍神經(jīng)病變[5-6]，以及治療血管性頭痛和抑制腫瘤[7-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方面，苦碟子注射液被證實(shí)能通過抗氧化應(yīng)激、抑制黏附分子表達(dá)等機(jī)制對(duì)膿毒血癥和橫紋肌溶解所致急性腎損傷起到保護(hù)作用[9-10]。因此，筆者推測(cè)，苦碟子注射液能夠通過抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子表達(dá)從而減輕IRI。

血清Scr、BUN含量是臨床上評(píng)價(jià)腎功能的常用指標(biāo)之一，本研究發(fā)現(xiàn)IRI組與Sham組比較，血中Scr、BUN含量大幅升高，由此說明缺血再灌注模型成功復(fù)制，而KDZ組血清Scr、BUN含量均低于IRI組，提示苦碟子注射液本身不僅不會(huì)造成腎損害，還可以改善缺血再灌注損傷腎臟的腎功能情況。

氧化應(yīng)激在IRI過程中發(fā)揮重要作用，氧自由基與脂性自由基性質(zhì)活潑，能攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷的作用，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹變形，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制失靈。有研究證實(shí)[11]，氧自由基是腎臟缺血再灌注損傷的重要介質(zhì)。SOD是組織產(chǎn)生的清除氧自由基的重要酶之一，反映機(jī)體清除氧自由基的能力，屬于抗氧化指標(biāo)，可以通過消除超氧陰離子從而減輕組織細(xì)胞損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，憑借組織中MDA含量可以評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱。腎臟發(fā)生缺血再灌注時(shí)會(huì)消耗了腎組織中SOD，升高M(jìn)DA含量。本研究表明，KDZ組與IRI組相比，腎組織勻漿中MDA含量下降，SOD含量升高，提示苦碟子注射液可以使組織抗氧化能力提高，氧化損傷程度減輕，對(duì)腎臟起到預(yù)防和保護(hù)作用。

研究表明[12]，炎癥反應(yīng)是缺血再灌注損傷最重要機(jī)制之一，腎組織缺血后，大量炎癥細(xì)胞在缺血部位聚集、浸潤，促使炎癥因子大量釋放，從而加重腎損傷。有研究表明[13-15]IL-6、ICAM-1等炎癥因子介導(dǎo)了損傷組織炎癥細(xì)胞浸潤，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，對(duì)缺血再灌注損傷起促進(jìn)作用。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族黏附分子，是腎臟缺血再灌注損傷所致急性腎衰竭的一個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)。正常情況下，在腎臟少量表達(dá)或不表達(dá)，在某些病理情況下其表達(dá)水平會(huì)出現(xiàn)上調(diào)。吳毅泰等[16]發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在腎臟缺血再灌注后24 h表達(dá)明顯，介導(dǎo)并參與了IRI損傷機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，ICAM-1在IRI組的含量高于Sham組，進(jìn)一步證實(shí)ICAM-1參與腎臟缺血再灌注損傷。IL-6由單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是具有多種功能的細(xì)胞因子。臨床研究發(fā)現(xiàn)[17]，細(xì)胞因子IL-6對(duì)IRI有加重作用。黃仁發(fā)等[18]發(fā)現(xiàn)IRI能夠誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生。因此在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的過程中其可以作為炎癥介質(zhì)較早出現(xiàn)，其表達(dá)量可以評(píng)價(jià)病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。本研究顯示，IRI組IL-6的表達(dá)最多，KDZ組較之減少，ELISA檢測(cè)ICAM-1含量結(jié)果顯示，ICAM-1在IRI組的含量最多，KDZ組其含量較前者減少，Sham組含量最低，由此提示，苦碟子注射液能降低大鼠腎臟缺血再灌注損傷過程中IL-6、ICAM-1的表達(dá)，從而減輕腎臟炎癥損傷。

綜上所述，筆者考慮苦碟子注射液能夠減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激及減輕炎癥損傷有關(guān)，希望能夠?yàn)榕R床早期預(yù)防腎臟缺血再灌注損傷及其他臟器損傷提供新的治療思路。

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