王麗梅，梁迎東，楊曉珍，藍(lán)海

[1.大理大學(xué)第三附屬醫(yī)院（云南省大理州人民醫(yī)院） 口腔科，云南 大理671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理671000]

齲病是高發(fā)的口腔疾病，嚴(yán)重危害人類的身心健康。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將齲齒列為人類重點(diǎn)防治的疾病之一[1]。齲病預(yù)防研究的核心是如何降低宿主對(duì)齲病的易感性，即增強(qiáng)牙齒硬組織的抗酸能力[2]。普洱茶是以云南特有的大葉茶的曬青毛茶為原料，經(jīng)特殊發(fā)酵工藝生產(chǎn)而成的。普洱茶中含有糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、氟、維生素、兒茶素、茶多酚等。其中已證明氟和茶多酚具有防齲的作用。普洱茶中的水溶性氟含量為77 mg/kg，就氟含量而言，普洱茶是良好的防齲飲品。普洱茶分為熟茶和生茶2種，二者在品質(zhì)特征上有明顯的差異，內(nèi)含物的化學(xué)成分也存在較大差異[3]。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定經(jīng)普洱茶（生茶、熟茶）不同濃度水浸液處理離體牙前后乳酸鹽緩沖溶液中磷離子濃度的變化，計(jì)算出磷溶出率，研究普洱茶（生茶、熟茶）水浸液對(duì)牙釉質(zhì)脫礦作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

普洱茶，購(gòu)于大理市下關(guān)鎮(zhèn)沃爾瑪超市，品名：圣邦普洱茶禮盒，廠址：普洱市思茅區(qū)振興路柏枝寺，生產(chǎn)日期：2011年5月28日。

1.2 儀器

SB25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），電子天平（波特樂(lè)-托利多儀器有限公司），T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），燒杯，容量瓶，移液管。

1.3 試劑

氫氧化鈉（上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司），抗壞血酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸二氫鉀（天津市化學(xué)試劑研究所），鉬酸銨（天津市化學(xué)試劑四廠凱達(dá)化工廠），乳酸（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。以上均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 普洱茶（生茶、熟茶）水浸液的制備 稱取普洱茶生茶9.6 g，加入到150 ml蒸餾水中，煮沸1 min，得到100 ml普洱茶水浸液，冷卻至室溫，倍比稀釋依次得到50 ml的96、48、24、12和6 mg/ml的普洱茶生茶水浸液，備用。熟茶水浸液依此法制得。

1.4.2 牙齒標(biāo)本的制備 去市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)新鮮牛牙齒100顆，切去壓根，去除牙髓和軟組織，超聲清洗，從中選出無(wú)裂痕、無(wú)齲損的牙齒72顆，分為12組，每組6顆，在陰涼處晾干備用。

1.4.3 乳酸鹽緩沖溶液的制備 2 ml的乳酸稀釋至400 ml，84 g氫氧化鈉溶于600 ml蒸餾水中，將稀釋好的乳酸鹽緩沖溶液與氫氧化鈉溶液混合，并稀釋至2 L，攪拌均勻，備用。

1.4.4 脫保護(hù)處理 將選出的牙齒浸入100 ml乳酸鹽緩沖溶液中2 h，充分除去牙齒表面的抗溶解保護(hù)，每次緩沖液的用量為100 ml，1 h更換1次緩沖液，2 h后取出牙齒，備用。

1.4.5 抑制牙釉質(zhì)脫礦實(shí)驗(yàn) 第1次酸蝕：將裝有牙齒（每組6顆）的12個(gè)燒杯，分別浸入37℃恒溫水浴30 min，取出燒杯，在每個(gè)燒杯中加入40 ml乳酸鹽緩沖溶液，15 min后分別將各只燒杯里的乳酸鹽緩沖溶液收集到12只50 ml的容量瓶中密封保存，備用。用蒸餾水將各組牙齒反復(fù)沖洗3～5次。牙齒處理：分別取普洱茶（生茶、熟茶）不同濃度（96、48、24、12和6 mg/ml）水浸液、去離子水、20 mg/ ml氟化鈉溶液各40 ml，加入所對(duì)應(yīng)的牙齒樣品中，5 min后傾倒處理液。用蒸餾水將各組牙齒反復(fù)沖洗3次。第2次酸蝕：將普洱茶（生茶、熟茶）不同濃度（96、48、24、12和6 mg/ml）水浸液、去離子水、20 mg/L氟化鈉溶液處理過(guò)的牙齒再次分別放入40 ml乳酸鹽緩沖溶液中，方法同第1次酸蝕。將第2次酸蝕后的乳酸鹽緩沖溶液收集到另外12只50 ml容量瓶中密封保存，備用。

1.5 牙釉質(zhì)磷濃度降低率的測(cè)定

1.5.1 磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀0.439 g溶于蒸餾水并定容至100 ml（含磷1 mg/ml），使用時(shí)稀釋500倍（含磷2μg/ml）。

1.5.2 25 g/L鉬酸銨溶液的配制 稱取2.5 g鉬酸銨，加蒸餾水20 ml，15 ml濃硫酸溶解，用水稀釋至100 ml。

1.5.3 抗壞血酸的制備 稱取10 g抗壞血酸溶于適量蒸餾水中，稀釋至100 ml。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[[44]]分別吸取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、10.00 和15.00 ml，置于8只50 ml刻度管中，加水至25 ml，搖勻，加2 ml 25 g/L鉬酸銨溶液，搖勻，放置30 s，加1 ml抗壞血酸，加水至50 ml，于室溫下顯色15 min，在波長(zhǎng)325 nm，1 cm比色杯條件下，以蒸餾水作為參比，測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.4869x-0.0026，r=0.999 6。

采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定磷酸鹽緩沖液中的磷含量[5]。在波長(zhǎng)為325 nm處測(cè)定非還原性磷鉬酸銨化合物的吸光度A，得磷含量的計(jì)算公式，C=（A+0.0026）/1.4869。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組總體均數(shù)之間比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用DunnettT3檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

用繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定2次酸蝕乳酸鹽緩沖溶液中的磷含量，計(jì)算磷濃度降低率（ESR），ESR=（C1-C2）/C1，經(jīng)單因素方差分析，各濃度組總體均數(shù)不全相等（F=105 695.866，P=0.000）。普洱茶（生茶、熟茶）不同濃度組的ESR與氟化鈉組和去離子水組的ESR比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同一濃度組的普洱茶生茶組和熟茶組比較，除6 mg/ml生茶和12 mg/mL熟茶組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明普洱茶熟茶組的再礦化效果整體上要比生茶組的好。生茶6 mg/ml組與熟茶12 mg/ml組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明這兩組抑制牙釉質(zhì)脫礦作用相差不大。普洱茶（生茶、熟茶）96和48 mg/ml這2個(gè)濃度組的作用均＞20 mg/L 氟化鈉組，其余3個(gè)相對(duì)較低濃度組的作用均＜20 mg/ mL 氟化鈉組?？傮w表明：普洱茶（生茶、熟茶）不同濃度水浸液都有抑制牙釉質(zhì)脫礦的作用，且隨著普洱茶水浸液的茶濃度增大抑制作用越強(qiáng)。生茶與熟茶的抑制牙釉質(zhì)脫礦的作用效果不同，總體來(lái)說(shuō)，熟茶抑制牙釉質(zhì)脫礦的作用效果優(yōu)于生茶。見(jiàn)附表。

附表 牙釉質(zhì)磷濃度降低率（ESR） （±s）

附表 牙釉質(zhì)磷濃度降低率（ESR） （±s）

注：（s：×10-3）；C1為處理液處理前磷溶出量；C2為處理液處理后磷溶出量；1）表示與陰性對(duì)照組相比，P ＜0.05；2）表示與陽(yáng)性對(duì)照組相比，P ＜0.05；3）表示同一濃度的不同實(shí)驗(yàn)組相比，P ＜0.05

ESR生茶 96 mg/ml組 0.186 7±0.548 0.101 1±0.837 0.458 7±4.9701）2）3）生茶 48 mg/ml組 0.188 3±0.837 0.127 5±1.000 0.322 8±5.9301）2）3）生茶 24 mg/ml組 0.186 3±0.245 0.163 3±0.894 0.123 7±8.0801）2）生茶 12 mg/ml組 0.189 9±0.894 0.174 5±0.894 0.079 8±2.3101）2）3）生茶 6 mg/ml組 0.188 3±0.474 0.175 5±0.894 0.068 1±4.5501）2）3）20 mg/L氟化鈉組 0.188 2±0.837 0.151 3±0.474 0.196 3±2.050去離子水組 0.187 3±0.164 0.180 4±0.474 0.037 0±8.850熟茶 96 mg/ml組 0.189 8±0.000 0.112 6±0.474 0.406 8±2.6801）2）3）熟茶 48 mg/ml組 0.186 3±0.837 0.124 2±0.894 0.333 0±2.8801）2）3）熟茶 24 mg/ml組 0.189 4±1.095 0.166 7±0.474 0.120 1±7.1601）2）3）熟茶 12 mg/ml組 0.188 6±0.548 0.175 6±0.837 0.068 6±3.2901）2）熟茶 6 mg/ml組 0.188 5±1.643 0.178 3±0.707 0.055 0±21.2101）2）3）組別C1C2

3 討論

致齲菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸會(huì)使牙釉質(zhì)中的主要成分羥基磷灰石與氫離子反應(yīng)，從而使羥基磷灰石晶體解體，使牙釉質(zhì)脫礦，發(fā)生齲齒。研究證實(shí)普洱茶中含有氟、茶多酚等成分，氟離子，能在牙釉質(zhì)表面形成氟化鈣沉淀，同時(shí)氟離子進(jìn)入釉質(zhì)中生成晶格更小、穩(wěn)定性更強(qiáng)的氟磷灰石，促進(jìn)牙質(zhì)的再礦化，增強(qiáng)了牙釉質(zhì)對(duì)酸的抵抗力，從而抑制牙釉質(zhì)脫礦，達(dá)到防齲的作用[6]。另外，茶多酚能改變膠原的性質(zhì)，從而抑制多種致齲菌在牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)上的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸[7]，從而抑制牙釉質(zhì)的脫礦。

通過(guò)測(cè)定經(jīng)普洱茶（生茶、熟茶）不同濃度水浸液處理離體牙前后乳酸鹽緩沖溶液中磷離子濃度的變化，計(jì)算磷溶出率可知，相同條件下，普洱茶（生茶、熟茶）不同濃度水浸液均具有抑制牙釉質(zhì)脫礦的作用，隨著普洱茶水浸液的茶濃度增大抑制作用越強(qiáng)，且有4個(gè)濃度生茶組的作用強(qiáng)度大于熟茶組，1個(gè)濃度熟茶組的作用強(qiáng)于生茶組。普洱茶中含有抑制牙釉質(zhì)脫礦的活性物質(zhì)茶多酚和氟，鄒艷麗等[8]報(bào)道生茶的茶多酚含量普遍高于熟茶，而熟茶的氟含量又高于生茶，最高可達(dá)32.7倍[9]，所以，普洱茶的抗酸脫礦作用是茶多酚的作用還是氟的作用或者是二者的協(xié)同作用有待于進(jìn)一步的研究。另外，普洱茶葉片的成熟程度也會(huì)影響氟的含量，一般偏老葉片的氟含量高于嫩葉。

本實(shí)驗(yàn)在環(huán)境控制中存在一些局限，如果能更好地模擬出人喝茶時(shí)茶液在口腔里的環(huán)境，結(jié)果將更為可靠。

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