梁齊飛，云健健，楊鳳元，黃熙

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林，541001）

鮮紅斑痣（port wine stains，PWS）是皮膚毛細血管的擴張及畸形，對患者容貌影響較大，是臨床治療的難點。光動力療法（photo dynamic therapy，PDT）近年來應用于PWS的臨床治療，取得一定療效。PDT根據(jù)光敏劑使用方法不同主要分為靜脈注射（如血卟啉單甲醚）和局部外用（如5-氨基酮戊酸）等，前者療效較好，但存在用量大、費用高、代謝慢、治療后需長時間避光、易引起光敏反應等缺點，限制了臨床使用。為避免靜脈注射光敏劑的缺點，局部外用5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）光動力療法已嘗試用于PWS治療，但存在經(jīng)皮滲透較弱的問題?；谕庥盟幬锝?jīng)皮滲透的最大障礙是表皮角質(zhì)層的特點，已有研究證實微針作用下表皮角質(zhì)層的完整性破壞，可使藥物經(jīng)皮吸收增強。為提高5-ALA的經(jīng)皮滲透性，設(shè)想通過微針作用來增加5-ALA滲透。因此本實驗開展了微針作用于雞冠后，5-ALA代謝產(chǎn)生的PpIX在雞冠組織中的藥代動力學研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

5-ALA（規(guī)格118 mg，復旦張江生物制藥有限公司），原卟啉IX（PpIX）（250 mg，Aladdin-阿拉丁試劑上海有限公司），抗熒光衰減封片劑（5 ml，北京索萊寶科技有限公司），皮膚滾針（針長0.25 mm，蘇州秀諾光電科技有限公司），熒光分光光度計（RF-5301pc，島津企業(yè)管理中國有限公司），倒置熒光相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司），半微量天平（MS105DU，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 實驗動物

成年雄性萊亨雞（動物合格證號4104035）24只，體重2.0～2.5 kg。雞冠厚度8～10 mm，色澤紅潤，顏色均勻，無潰瘍壞死等，實驗前口服水合氯醛（2 ml/kg）麻醉。

1.3 實驗方法

1.3.1 PpIX在組織內(nèi)分布 取12只萊亨雞，隨機分為5-ALA組和微針聯(lián)合5-ALA組，每組6只。雞冠一側(cè)用亞甲藍和碘伏標記6塊0.6 cm×0.6 cm區(qū)域為實驗區(qū)域，對側(cè)不做處理為自身對照。使用滅菌注射用水配制20%濃度的5-ALA，5-ALA組：實驗區(qū)域放置等面積紗布2層，將5-ALA溶液滴于紗布上，塑料薄膜封包，錫紙包扎后避光放置；微針聯(lián)合5-ALA組：雞冠先用微針滾磨后，將20% 5-ALA涂抹于實驗區(qū)域，避光放置。兩組均在6 h內(nèi)每h用皮膚環(huán)鉆切取一塊組織做冷凍切片，抗熒光衰減封片劑封片后，倒置熒光相差顯微鏡下觀察PpIX分布，選擇黃色激發(fā)塊（BP545-580，DM600，BA610-1F），明視場對應3號濾光片，曝光指數(shù)400，觀察放大×200倍圖像，并拍照記錄。

1.3.2 雞冠組織PpIX含量 ①標準液的配制及標準方程確定：結(jié)合張波等[1]的方法配制標準液。Matlab多項式擬合得出標準方程：y=0.0296X4-0.1450X3+0.2751X2-0.2253X+0.0688；其中X為PpIX熒光強度對數(shù)值，y為抽提液PpIX濃度（mg/L），擬合度0.9989，曲線擬合成立。組織PpIX含量（Yt）=y×抽提液體積/組織質(zhì)量（ng/g）；②另12只萊亨雞，同樣隨機分為5-ALA組和微針聯(lián)合5-ALA組，兩組處理與第一步相同，從第2～7 h每h用皮膚環(huán)鉆切取一塊組織，電子天平稱重后放入陶瓷研缽內(nèi)，加入適量液氮碾磨成粉，加入1.0 ml hepes buffer，室溫下混勻，再加入1.0 ml hepes buffer，充分混勻后，移入離心試管中，加入5 ml乙酸乙酯：冰醋酸（4∶1）混合液，混勻，轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心1 min，以除去蛋白質(zhì)，取上清液，并加入4 ml 0.5 NHCl，劇烈振搖、混勻，轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心1 min，靜置，待充分分層后，取下層液體行熒光分光光度計檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，測得結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，不同時間點比較采用重復測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PpIX組織內(nèi)分布

選取第1～6 h每h切取一塊雞冠組織。由于石蠟切片自發(fā)熒光強，而且在脫蠟處理中會造成PpIX丟失與熒光淬滅，采用冷凍切片后在倒置熒光相差顯微鏡下觀察PpIX熒光分布。由于表皮層有自發(fā)熒光現(xiàn)象，拍攝正常雞冠組織切片作比較，可觀察到正常雞冠表皮層有微弱的熒光。5-ALA組和微針聯(lián)合5-ALA組表皮和真皮組織都觀察到有彌漫性PpIX熒光分布，真皮中PpIX主要集中在血管組織周圍，熒光強度隨時間逐漸增強，3～5 h熒光最強，6 h開始減弱，且微針聯(lián)合5-ALA組熒光強度較5-ALA組高。見圖1、2。

2.2 雞冠組織PpIX含量

圖1 部分切片明視場圖像和正常對照組圖片 （×200）

圖2 不同時間PpIX在雞冠組織內(nèi)熒光分布 （×200）

根據(jù)冷凍切片觀察結(jié)果，從第3 h開始熒光強度增強，第6 h開始下降，因此選擇于第2～7 h切取組織測定PpIX含量。結(jié)果顯示，PpIX含量隨時間增加逐漸增多，第3 h開始增多，第4 h達高峰，第5 h開始緩慢下降。微針聯(lián)合5-ALA組和5-ALA組第2 ～ 7 h靜息狀態(tài)下產(chǎn)生PpIX含量的比較，采用重復測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點間的PpIX含量有差別（F=601.005，P=0.000）；②微針聯(lián)合5-ALA組與5-ALA組靜息狀態(tài)下相同時間產(chǎn)生PpIX含量有差別（F=36.997，P=0.000），且微針聯(lián)合5-ALA組與5-ALA組比較每h產(chǎn)生PpIX量更多，說明2種不同處理方法對生成PpIX影響差異有統(tǒng)計學意義；③兩組PpIX含量變化趨勢有差別（F=6.390，P=0.000），說明時間與處理方法的交互作用差異有統(tǒng)計學意義。見附表、圖3。

附表 兩組各時間點PpIX含量比較 （±s，ng/g）

附表 兩組各時間點PpIX含量比較 （±s，ng/g）

組別 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 7 h 5-ALA 組 151.94±10.33 354.68±5.33 636.27±27.55 530.66±51.91 429.23±24.51 336.02±25.26微針聯(lián)合5-ALA組 180.88±7.08 389.06±6.36 689.76±41.30 643.67±36.41 470.65±22.41 381.97±8.01

圖3 5-ALA組（A）和微針聯(lián)合5-ALA組（B）PpIX含量不同時間變化趨勢

3 討論

1994年，我國學者吳洋等[2]研究發(fā)現(xiàn)雞冠與人毛細血管瘤組織結(jié)構(gòu)相似，血紅蛋白和皮膚光吸收特性也基本相同，因此用雞冠作為PWS動物模型是可行的。PWS是一種先天性疾病，病理改變?yōu)檎嫫\層毛細血管擴張畸形。PDT是目前治療PWS的最佳方法[3]，它對于不同年齡段和不同類型的PWS都顯示出很好療效，且不良反應很少[4]。但是目前PDT治療PWS常用的靜脈用光敏劑血卟啉單甲醚（HMME）存在著用量大、費用高、治療后需長時間避光、可引起光敏反應[4]等缺點，給患者生活帶來不便。

5-ALA是生成亞鐵血紅素生物合成通路中的PpIX的前體物質(zhì)。PpIX是一種內(nèi)源性光敏劑，當暴露于它的作用光譜后，可產(chǎn)生活性氧進而破壞靶細胞。李偉等[5]采用局部注射或靜脈注射的方法在雞冠中測得高水平PpIX聚集，王嬌等[6]研究發(fā)現(xiàn)外用5-ALA PDT對雞冠毛細血管有明顯損傷，都提示5-ALA可用于PWS的治療。PDT的效果取決于光、光敏劑和氧3個因素，在光和氧一定的情況下，提高光敏劑效果將會對PDT療效產(chǎn)生重要影響。因為5-ALA的親水和有兩性離子特性，皮膚滲透存在一些障礙。為提高外用5-ALA的滲透，學者們采用了很多方法，如電離子透入、皮內(nèi)注射、口服和靜脈注射等。皮內(nèi)注射存在著用量不容易控制和用藥不均的缺點，而口服和靜脈注射有潛在的副作用[7]。DONNELLY[8]等通過裸鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，使用微針可以縮短應用時間和需要的5-ALA劑量，而獲得皮膚中高水平的PpIX。受其啟發(fā)，本研究采用微針處理后外用5-ALA的方式，研究5-ALA在雞冠組織中合成PpIX量的情況，觀察是否可促進5-ALA滲透，進而提高PDT療效。

微針一般是指尖端直徑在幾十微米以下，長度＞1～2 mm的微型針頭。它通過短暫、可逆地破壞皮膚的致密屏障角質(zhì)層，形成與皮膚垂直的微小通道，有效促進藥物的經(jīng)皮滲透和在特定部位蓄積[9]。通常治療用的微針陣列長度＜700μm，僅穿透角質(zhì)層，不會深達神經(jīng)和血管分布豐富的真皮層，故不會產(chǎn)生疼痛感和出血[10]。李偉澤等[11]研究發(fā)現(xiàn)，微針在皮膚上形成的孔道不會促進細菌進入小鼠機體引起感染，也不會引起新生大鼠皮膚損傷的基因異常表達。光鏡下清晰顯示，微針處理后72 h，角質(zhì)層受損區(qū)會自動且完全修復，故皮膚刺激性短暫、輕微[12]。微針滾磨情況可能是實驗的影響因素之一，為了最大程度減少誤差，本實驗由同一位操作者在相同的環(huán)境下（包括溫度、濕度等），每只實驗動物滾磨相同的次數(shù)，用力盡量保持一致。

本實驗觀察到，5-ALA代謝產(chǎn)生的PpIX主要在表皮層和真皮血管組織中聚集，而PWS治療的靶組織就是毛細血管，微針聯(lián)合5-ALA后再使用一定波長激光照射，將會更有效地損傷毛細血管。在實驗觀察的7 h內(nèi)，3 h兩組PpIX含量開始增多，4 h達高峰，5 h時仍有很高濃度，提示4～5 h是PDT最佳照光時間。且微針聯(lián)合5-ALA組的PpIX含量與單純5-ALA組比較，差異有統(tǒng)計學意義，說明5-ALA能夠進入完整雞冠皮膚，而微針作用破壞了角質(zhì)層的完整性，可以更好的促進5-ALA的滲透。

本實驗是微針促進外用光敏劑滲透的初步探索，對于微針聯(lián)合5-ALA后，選擇多少能量及功率密度的激光照射更合適，有待于進一步研究。

[1]張波, 張陽德, 王紹闖, 等. 5-氨基乙酰丙酸誘導原卟啉IX在大腸癌模型大鼠血液中積聚的實驗研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志, 2004, 14(23): 53-58.

[2]吳洋, 呂春堂, 趙晉龍, 等. 雞冠、肉垂與國人毛細血管瘤區(qū)皮膚光吸收特性的比較研究[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志, 1994, 10(4):282-284.

[3]甄潔, 王穎, 顧瑛. 鮮紅斑痣組織光學模型構(gòu)建的研究進展[J].中國激光醫(yī)學雜志, 2015, 24(2): 95-100.

[4]苑凱華, 李勤, 張超, 等. 脈沖染料激光與光動力療法治療鮮紅斑痣臨床對比分析[J]. 臨床皮膚科雜志, 2009, 38(2): 126-128.

[5]李偉, 周兆平, 橋本賢二. 5-氨基酮戊酸代謝產(chǎn)物原卟啉IX在葡萄酒色斑動物模型雞冠中的積聚[J]. 中國美容醫(yī)學, 2009,18(1): 60-63.

[6]王嬌, 黃熙. 氨基酮戊酸光動力療法對鮮紅斑痣動物模型雞冠的影響[J]. 中華皮膚科雜志, 2015, 48(5): 353-357.

[7]FERNANDA H S, APOSTOLOS G D, WILLIAM A F, et al.Intracutaneous ALA photodynamic therapy: dose-dependent targeting of skin structures[J]. Laser Surg Med, 2011, 43(7): 621-631.

[8]DONNELLY R F, MORROW D I J, MCCARRON P A, et al.Microneedle-mediated intradermal delivery of 5-aminolevulinic acid: potential for enhanced topical photodynamic therapy[J]. J Control Release, 2008, 129(3): 154-162.

[9]ITA K. Transdermal delivery of drugs with microneedles-potential and challenges[J]. Pharmaceutics, 2015, 7(3): 90-105.

[10]KAURA M, ITAA K B, POPOVAB I E, et al. Microneedleassisted delivery of verapamil hydrochloride and amlodipine besylate[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2014, 86(2): 284-291.

[11]李偉澤, 張寒, 韓文霞, 等. 實體微針透皮給藥的安全性研究[J].中國藥學雜志, 2011, 46(23): 1818-1822.

[12]ITO Y, HAGIWARA E, SAEKI A, et al. Feasibility of micro needles for percutaneous absorption of insulin[J]. Eur J Pharm Sci, 2006, 29(1): 82-88.