凌云，程婷，宋禮華

（1.績溪縣食品藥品監(jiān)督管理局，安徽 績溪 245300；2.安徽安科生物工程（集團）股份有限公司，安徽合肥 230088）

鹽酸米托蒽醌（Mitoxantrone，DHAD）是一種具有蒽環(huán)結(jié)構(gòu)的廣譜抗腫瘤抗生素，通過其自身化學(xué)結(jié)構(gòu)的“嵌插”機制，可阻斷腫瘤細胞DNA的合成、轉(zhuǎn)錄，對多種臨床常見的腫瘤細胞有明確療效［1-3］。但該藥具有較明顯的骨髓抑制、心臟毒性及白細胞減少等不良反應(yīng)［4-5］。將抗腫瘤藥物制備成脂質(zhì)體，可改變藥物的分布性質(zhì)，從而實現(xiàn)對藥物動力學(xué)的優(yōu)化，減少不良反應(yīng)［6］。在制備脂質(zhì)體時，通過添加聚乙二醇（PEG）磷脂，將高分子材料嵌插入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)從而改變脂質(zhì)體表面性質(zhì)，可顯著提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，延長血循環(huán)時間提高藥物作用效果。隨著研究的不斷深入，PEG修飾技術(shù)與包封藥物的釋放性能之間的關(guān)系、是否會對釋藥造成負面影響，目前研究觀點仍未達成一致意見［7-8］。為探索PEG化修飾對脂質(zhì)體制劑細胞毒作用的影響，本課題制備了DHAD PEG化脂質(zhì)體（DHAD-PEG-L），以DHAD水溶液模擬常規(guī)DHAD制劑為參比、以人非小細胞肺癌A549細胞為模型開展細胞藥效學(xué)試驗，從而明確DHAD減毒增效的改造方向，以期提高藥物化療效果，減少不良反應(yīng)，提高患者生存質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器 細胞培養(yǎng)箱（2123-TC，SHEL-LAB）；倒置顯微鏡（OLYMPUS）；光吸收讀板機（Molecular Devices）；超凈工作臺（蘇凈）；冷凍離心機（BECKMAN）；細胞培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板（Costar）；Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱（Pharmacia）；高效液相色譜（Waters）；紫外檢測儀（上海琪特）；Nano ZS粒度分析儀（Malvern）。

1.2 試劑 DHAD原料藥（湖北健源化工，純度＞99%）；PEG化空白脂質(zhì)體由安徽安科生物工程股份有限公司協(xié)助制備（成分規(guī)格：氫化磷脂8.8 g·L－1、PEG磷脂 2.95 g·L－1、膽固醇 2.95 g·L－1）；RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清及胰蛋白酶（GiBco）；MTT（Solarbio）；L-谷氨酰胺、Triton100、丙酮酸鈉、二甲亞砜（DMSO）均購自國藥集團有限公司（分析純）。

1.3 細胞 A549人非小細胞肺癌細胞株（由安徽安科生物工程股份有限公司提供）。

1.4 方法

1.4.1 主動載藥法制備脂質(zhì)體藥物 移取適量空白PEG化脂質(zhì)體至透析袋，置1 000倍體積的生理鹽水中透析10 h，置換PEG脂質(zhì)體外相液，并以1.0 mol·L－1NaOH溶液調(diào)節(jié)外相pH值至7.4附近。精密移取4.5 mL空白PEG脂質(zhì)體和0.5 mL DHAD溶液（10.0 g·L－1）至試管中混勻，60℃恒溫水浴孵育30 min，即得載藥PEG化脂質(zhì)體DHAD-PEG-L。

1.4.2 載藥脂質(zhì)體的理化表征 粒徑和Zeta電位：以適量生理鹽水對DHAD-PEG-L進行稀釋后，使用粒度電位分析儀進行測定，計算平均粒徑、電位和粒徑分布。包封率：使用Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱洗脫脂質(zhì)體溶液，流動相為生理鹽水，洗脫速度1.0 mL·min－1；收集脂質(zhì)體峰，以Triton-100溶解破壞脂質(zhì)體膜后使用HPLC以標(biāo)準曲線法測定包封藥物的含量，參照以下公式計算包封率［9］。

1.4.3 細胞復(fù)蘇及培養(yǎng) A549細胞以37℃溫水融化復(fù)蘇，以1 000～2 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3～5 min。小心吸去上清液，加入1.0 mL預(yù)熱的細胞培養(yǎng)液，將細胞吹散后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。補充 RPMI 1640培養(yǎng)基4.0 mL，并添加10%的小牛血清。置于培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)（CO2濃度5%）。A549細胞消化傳代頻率為1次／周，換液間隔為3 d。

1.4.4 細胞增殖抑制試驗 取對數(shù)生長期的A549細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基配制單細胞懸液（每毫升細胞個數(shù)1.0×105個），以每孔100.0μL接種于96孔板，37℃常規(guī)培養(yǎng)（CO2濃度5%）4 h。實驗設(shè)3組：分別將DHAD-PEG-L、DHAD溶液和空白脂質(zhì)體稀釋成 250、25、2.5、0.25、0.025、0.002 5 mg·L－1共6個梯度濃度作為制劑測試組。其中，空白脂質(zhì)體的稀釋方法以4.5 mL空白PEG脂質(zhì)體加入0.5 mL生理鹽水溶液的混合物為原液，參照含藥組進行同倍數(shù)稀釋。DHAD-PEG-L每孔加藥量為100.0μL，另設(shè)置空白對照組（加入生理鹽水與腫瘤細胞）和校零組（單純培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5.0 g·L－1的MTT溶液20.0μL，震蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后以2 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液，每孔加入 DMSO 150.0μL，震蕩溶解結(jié)晶后以讀板機進行光吸收掃描，設(shè)定波長490 nm，記錄數(shù)據(jù)并分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 半數(shù)抑制濃度IC50值的計算：每組吸光度A490nm均值依以下公式求算細胞抑制率，并使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件計算IC50值。

DHAD-PEG-L、DHAD溶液和空白PEG脂質(zhì)體在不同濃度下對A549細胞抑制作用的結(jié)果，使用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。以單因素方差分析法對腫瘤細胞抑制作用進行組間比較，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的理化性質(zhì) 經(jīng)粒度電位分析儀檢測，本實驗制備獲得的DHAD-PEG-L平均粒徑為（103.6±2.8）nm，平均Zeta電位為（－12.2±1.0）mV，粒徑分布 D10平均值為（38.2±1.1）nm，D50平均值為（79.6±2.5）nm，D90平均值為（160.7±3.1）nm。各批次DHAD-PEG-L的粒徑、粒徑分布和Zeta電位檢測結(jié)果如表1所示。

上述DHAD-PEG-L經(jīng)柱層析、表面活性劑破膜處理后通過HPLC進行定量分析，計算獲得3批次DHAD-PEG-L的包封率分別為（95.2±2.4）%、（94.3±1.6）%和（95.8±1.8）%，平均包封率為（95.1±1.9）%。

表1 DHAD-PEG-L的粒徑參數(shù)及Zeta電位／x±s

2.2 IC50值 DHAD-PEG-L、DHAD溶液對 A549細胞作用48 h后的IC50值分別為（1.561±0.09）、（0.862±0.02）。

2.3 腫瘤細胞抑制作用的差異性 經(jīng)方差分析，各組的制劑類型因素和濃度因素有交互效應(yīng)（F＝13 770.736、P＜0.001），說明不同制劑對 A549細胞的抑制作用隨濃度變化而變化。三組制劑在不同濃度時細胞抑制率的組間比較采用單因素方差分析法，結(jié)果顯示DHAD-PEG-L組、DHAD溶液組各濃度的細胞抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明兩種含藥制劑均能抑制 A549細胞增殖（FPEG＝26 754.289、PPEG＜0.001；FDHAD＝16 753.559、PDHAD＜0.001）；空白脂質(zhì)體組各濃度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F空白脂質(zhì)體＝0.929、P空白脂質(zhì)體＝0.496），推斷空白脂質(zhì)體對A549細胞增殖沒有抑制作用。在相同濃度條件下，不同制劑組細胞抑制率的組間比較采用單因素方法分析后進行兩兩比較，結(jié)果均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，當(dāng)藥物濃度范圍在0.002 5～0.25 mg·L－1時，DHAD-PEG-L的細胞抑制作用顯著強于DHAD溶液；當(dāng)濃度在2.5～250 mg·L－1時，DHAD-PEG-L的細胞抑制作用顯著弱于DHAD溶液。見表2。

表2 不同濃度的DHAD-PEG-L、DHAD溶液和空白脂質(zhì)體對A549細胞的抑制作用／x±s

圖1 兩種制劑對A549細胞增殖抑制作用的顯微成像圖（濃度0.25 mg·L－1）

通過顯微成像圖可以直觀看出，當(dāng)藥物濃度為0.25 mg·L－1時，經(jīng) DHAD-PEG-L作用的 A549細胞凋亡明顯，PEG修飾脂質(zhì)體的優(yōu)勢開始展現(xiàn)。見圖1。

3 討論

鑒于臨床上以DHAD治療人非小細胞肺癌應(yīng)用較為常見，本研究選擇A549細胞和MTT法開展細胞抑制實驗研究，方法簡捷、可靠性高。值得注意的是，MTT法的常用掃描波段540～595 nm會與DHAD吸收波長范圍（500～700 nm）發(fā)生干擾，因此本研究選擇490 nm波長作為折中［10-11］，實驗取得良好效果。

本研究表明，與高濃度藥物組（≥2.5 mg·L－1）相比較時，PEG脂質(zhì)體藥物并未體現(xiàn)藥效學(xué)優(yōu)勢，癌細胞的抑制作用反比常規(guī)制劑低，這可能與PEG脂質(zhì)體表面的毛線團狀分子屏障有關(guān)，降低了腫瘤細胞與藥物的直接接觸和攝取。當(dāng)藥物濃度下降接近至常規(guī)用藥血藥濃度（≤0.25 mg·L－1）時，其細胞抑制作用開始優(yōu)于常規(guī)制劑，其機制可能與脂質(zhì)體包封高濃度藥物，使藥物局部濃度遠高于普通溶液狀態(tài)有關(guān)［12］，當(dāng)載藥PEG脂質(zhì)體被細胞攝取或附著于表面進行局部釋放時，可在腫瘤細胞局部形成高濃度作用區(qū)域，增強細胞抑制作用。這對于降低藥物的全身血藥濃度、實現(xiàn)靶向給藥從而減少或減輕患者的不良反應(yīng)有著重要意義。

脂質(zhì)體制劑經(jīng)PEG修飾后可獲得更長的血循環(huán)時間達到病灶［13］。本研究在理論上證實了注射相同劑量的PEG脂質(zhì)體藥物，相較于常規(guī)制劑，預(yù)期可使腫瘤部位獲得更高的藥物濃度，更好的抑制腫瘤生長，使患者耐受量增加，藥物毒副作用下降，減少不良反應(yīng)。然而，低濃度藥物組的PEG脂質(zhì)體對A549細胞總體抑制率不足10%，這表明在今后的研究中，應(yīng)當(dāng)加大載藥工藝和包封工藝的研究，并對細胞攝取機制進一步探索，優(yōu)化脂質(zhì)體膜材料的成分組成和結(jié)構(gòu)，增強藥物在腫瘤細胞局部的毒性殺傷作用，從總體上優(yōu)化腫瘤的治療效果。

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