曹玥，陳虎，陳凱，陳暢，張宗澤

（武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科，湖北武漢 430071）

糖尿病患者每年都需要花費(fèi)大量的醫(yī)療資源，而據(jù)報(bào)道，至2035年，全球范圍內(nèi)糖尿病的患病人數(shù)將從現(xiàn)在的3.82億增長(zhǎng)至5.92億［1］。糖尿病患者患病后各種并發(fā)癥眾多，以感染為最。糖尿病患者外科手術(shù)后感染易導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，膿毒癥是急性腎損傷（AKI）的首要病因，也是危重患者死亡的重要原因之一［2］。因此，如何改善糖尿病患者術(shù)后嚴(yán)重感染所致AKI，從而降低糖尿病患者術(shù)后病死率對(duì)臨床工作有重要意義。

烏司他?。║TI）是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，能夠抑制多種蛋白酶、脂水解酶、糖水解酶和不良刺激引起的炎性因子的釋放［3-4］。但是，UTI對(duì)于糖尿病患者合并膿毒癥時(shí)的腎臟保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道，作用機(jī)制不明。因此，本研究擬觀察UTI對(duì)2型糖尿病膿毒癥大鼠AKI的保護(hù)作用，同時(shí)探討其對(duì)全身炎性反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)和腎臟局部缺氧反應(yīng)的影響，為今后糖尿病合并膿毒癥患者的治療提供重要的理論依據(jù)。現(xiàn)將其實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床意義報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選取與分組 SPF級(jí)同批健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。造模前2周常規(guī)喂養(yǎng)，前一晚禁食不禁飲。隨機(jī)選取10只喂以普通飼料，作為空白對(duì)照組（C組）。剩余50只喂以高脂飼料，動(dòng)物飼料主要參照張新杰等［5］使用的方法自行配制。喂養(yǎng)5周后，高脂組按30 mg·kg－1體質(zhì)量腹腔單次注射鏈脲佐菌素（STZ），注射3 d后，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol·L－1為2型糖尿病大鼠造模成功。選取成模大鼠40只，隨機(jī)分為4組（n＝10）：糖尿病組（D組）、糖尿病假手術(shù)組（S組）、糖尿病膿毒癥組（DS組）、糖尿病膿毒癥UTI預(yù)處理組（U組）。

1.2 糖尿病膿毒癥大鼠模型 采用李寶貴等［6］的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）方法構(gòu)建糖尿病膿毒癥大鼠模型。首先采用2%戊巴比妥鈉溶液（2 mL·kg－1）對(duì)DS組和U組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后固定，常規(guī)消毒鋪單，腹正中線作10 mm切口，以“3-0”絲線盲腸根部結(jié)扎，注意避免回腸和盲腸腸系膜血管。用18＃穿刺針兩次貫通穿刺盲腸壁，各擠出0.1 mL腸內(nèi)容物，最后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)后禁食，自由飲水。U組大鼠手術(shù)前1 h給予UTI 10萬(wàn)U·kg－1，生理鹽水稀釋至1 mL尾靜脈緩慢注射（5 min）。對(duì)S組大鼠，常規(guī)麻醉消毒，開(kāi)腹找到盲腸，將其拉出腹外放置1 min，之后還納關(guān)腹。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 代謝籠收集各組大鼠術(shù)后12 h尿液標(biāo)本，雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）行尿微量白蛋白（UMA）定量檢測(cè)。稱體質(zhì)量，堿性苦味酸法測(cè)血尿肌酐，計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）。HE染色法觀察腎組織病理改變。ELISA法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）的含量。硫代巴比妥酸（TBA）法檢測(cè)血清中丙二醛（MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。Western blot法檢測(cè)腎組織低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理學(xué)改變 對(duì)照組的腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，近曲小管管壁充盈，胞質(zhì)豐富，胞核藍(lán)染，邊界清晰；D組及S組腎小球大致正常，而腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)病理?yè)p害，可見(jiàn)濁腫現(xiàn)象，部分細(xì)胞核淡染；DS組較D組及S組損害更加嚴(yán)重，腎小球腎和小管明顯濁腫，管腔狹窄，基底膜增厚，且細(xì)胞核淡染，部分核出現(xiàn)濃縮、破碎甚至溶解；U組腎小球結(jié)構(gòu)大致正常，體積有增大，少量腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)濁腫，部分細(xì)胞核淡染，但總體的病理?yè)p傷較DS組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織的病理學(xué)結(jié)果（HE染色×400）

2.2 UMA含量變化 各組間UMA含量不全相同（P＜0.05）；與C組相比，其余各組UMA均升高（P＜0.01）；D組與S組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與S組相比，DS組及U組UMA均升高（P＜0.01）；與DS組相比，U組UMA降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 Ccr變化 各組間Ccr不全相同（P＜0.05）；與C組相比，其余各組Ccr均降低（P＜0.01）；D組與S組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與S組相比，DS組及U組 Ccr降低（P＜0.05）；與 DS組相比，U組Ccr升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 血清IL-18和TNF-α含量變化 各組間血清IL-18和TNF-α含量均不全相同（P＜0.05）；與 C組相比，其余各組血清 IL-18、TNF-α均升高（P＜0.01）；D組與S組間的血清IL-18、TNF-α含量均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與S組相比，DS組血清IL-18、TNF-α均升高（P＜0.05）；與 DS組相比，U組血清 IL-18、TNF-α降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.5 血清MDA含量及SOD活性變化 各組間血清MDA含量及SOD活性均不全相同（P＜0.05）；與C組相比，其余各組血清MDA含量均升高（P＜0.01），SOD活性均下降（P＜0.01）；D組與S組間血清MDA含量和SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與 S組相比，DS組 MDA含量均升高（P＜0.05），DS組 SOD活性下降（P＜0.05），U組MDA含量均升高（P＜0.05）、SOD活性下降（P＜0.05）；與DS組相比，U組血清MDA含量下降（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組不同大鼠各個(gè)指標(biāo)比較／x±s

2.6 腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)變化 各組間腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)不全相同（P＜0.05）；與C組相比，其余各組腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01）；D組與S組間腎組織HIF-1α蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與S組相比，DS組大鼠腎組織的HIF-1α蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01），U組HIF-1α蛋白表達(dá)也升高（P＜0.05）；與DS組相比，U組腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 腎臟組織中AIF-1α蛋白表達(dá)水平

3 討論

2型糖尿病（T2DM）是一種復(fù)雜多樣的疾病，其發(fā)病與胰腺β細(xì)胞分泌胰島素相對(duì)減少和漸進(jìn)性的胰島素抵抗導(dǎo)致高糖血癥有關(guān)［7］。T2DM動(dòng)物模型眾多，主要有實(shí)驗(yàn)性、自發(fā)性和轉(zhuǎn)基因性T2DM動(dòng)物模型［8］。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料加小劑量STZ一次性腹腔注射來(lái)建立T2DM大鼠模型。這種方法能在使用小劑量STZ破壞大鼠胰島β細(xì)胞功能的同時(shí)，輔以高脂飼料造成外周組織對(duì)胰島素的敏感性降低，形成類似的T2DM模型。然后我們?cè)赥2DM基礎(chǔ)上采用CLP建立大鼠膿毒癥模型，相對(duì)于其他直接注射LPS等成分構(gòu)建膿毒癥模型的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)說(shuō)，這種動(dòng)物模型模仿了人類腸道手術(shù)后細(xì)菌感染導(dǎo)致膿毒癥的漸進(jìn)性臨床情境，而不是采用毒素進(jìn)行一次性打擊造成臟器損傷。有研究顯示，在行CLP術(shù)后，機(jī)體高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)將會(huì)持續(xù)8 h（術(shù)后2 h到術(shù)后10 h），機(jī)體在術(shù)后16 h左右開(kāi)始進(jìn)入低動(dòng)力的虛弱狀態(tài)，可持續(xù)到20 h左右［9］。另外有研究證實(shí)，雌性大鼠在同時(shí)行CLP和卵巢切除術(shù)后12 h到20 h間的死亡率達(dá)到33%，而糖尿病雌性大鼠在同時(shí)行CLP和卵巢切除術(shù)后6 h到20 h的死亡率則達(dá)到40%［10］。本實(shí)驗(yàn)也存在對(duì)大鼠行糖尿病和膿毒癥的雙重打擊，故本實(shí)驗(yàn)選擇在CLP術(shù)后12 h收集大鼠的血液和腎臟標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，這樣能在達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的同時(shí)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠的死亡率最低。最后，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，相較于對(duì)照組，DS組腎臟腎小球腎小管均嚴(yán)重受損，糖尿病膿毒癥大鼠AKI模型構(gòu)建成功。

UTI是從人類尿液中提純萃取出的含有143個(gè)氨基酸的糖蛋白，分子量為67 kDa，能夠有效抑制多種酶和不良刺激引起的炎性因子的釋放，同時(shí)也能夠通過(guò)穩(wěn)定溶酶體的細(xì)胞膜、吸收氧自由基以及阻止炎性因子的釋放來(lái)改善微循環(huán)。此外，許多研究顯示，UTI對(duì)于AKI都有保護(hù)作用［11-12］。而目前關(guān)于UTI對(duì)患有糖尿病的腸源性膿毒癥大鼠導(dǎo)致AKI的保護(hù)作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。而且，在某些患者經(jīng)歷較大手術(shù)如心肺轉(zhuǎn)流術(shù)時(shí)，使用UTI治療后測(cè)量患者腎臟生物標(biāo)記物后，發(fā)現(xiàn)UTI對(duì)于AKI不具有保護(hù)性作用［13］。在本研究中，U組相對(duì)于DS組，腎臟病理?yè)p傷明顯減輕，尿中微量白蛋白的含量明顯降低，Ccr明顯升高。結(jié)果說(shuō)明，在糖尿病膿毒癥大鼠發(fā)生AKI時(shí)，UTI對(duì)于的腎臟功能有明顯保護(hù)作用。

TNF-α是膿毒癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的炎性因子，早期出現(xiàn)，促進(jìn)膿毒癥發(fā)生發(fā)展。IL-18是一種新型的促炎因子，在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中，IL-18起重要作用，而且與膿毒癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（LPS）刺激之前予以UTI預(yù)處理治療，血清TNF-α含量能夠顯著降低，炎性反應(yīng)明顯減輕［14］。但是，UTI在某些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械目寡鬃饔貌⒉皇诛@著。在失血性休克患者中使用UTI，患者血中炎性因子如TNF-α和IL-6水平并沒(méi)有明顯變化［15］。也有研究發(fā)現(xiàn)，UTI能夠降低LPS刺激的單核細(xì)胞中TNF-α的含量，但是這種降低幅度并不明顯，不能充分證明UTI抗炎作用的有效性［16］。而在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠血清中的TNF-α和IL-18，相對(duì)于D組和S組，DS組明顯升高；而相對(duì)于DS組，U組明顯下降。膿毒癥感染可以明顯加重糖尿病大鼠的全身炎性反應(yīng)，使用UTI能夠明顯減輕在發(fā)生糖尿病膿毒癥時(shí)的全身炎性反應(yīng)，延緩膿毒癥發(fā)病過(guò)程。

氧自由基損傷是糖尿病膿毒癥時(shí)腎臟損傷的重要機(jī)制之一，膿毒癥時(shí)大量炎性因子釋放誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，造成機(jī)體內(nèi)氧化-還原狀態(tài)失衡，引起氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致腎臟損傷，糖尿病更會(huì)加速這一過(guò)程的發(fā)生發(fā)展。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)重要的代謝終產(chǎn)物之一，其濃度能夠直接反映出機(jī)體氧化損傷程度；SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的首要物質(zhì)，其活性水平高低能夠反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于D組和S組，DS組大鼠血清中的MDA含量升高，SOD活性降低；相對(duì)于DS組，U組大鼠血清中的MDA含量降低，SOD活性升高，變化趨勢(shì)與腎臟受損嚴(yán)重程度相關(guān)。這說(shuō)明膿毒癥感染明顯加重糖尿病大鼠的全身氧化應(yīng)激反應(yīng)；而UTI也是通過(guò)減少全身MDA釋放，提升SOD活性水平，從而減少氧自由基，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，來(lái)保護(hù)腎臟功能。

腎臟組織血流量大，耗氧量高，對(duì)缺血缺氧反應(yīng)敏感，易受缺氧損傷。而HIF-1α是特異性介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α的蛋白穩(wěn)定性受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)，在正常的氧環(huán)境中HIF-1α的含量很低，因?yàn)樵谡Ｑ鯘舛葧r(shí)，HIF-1α可以持續(xù)產(chǎn)生，但是卻很快被脯氨酰羥基化酶羥基化，最終被泛素-蛋白酶系統(tǒng)分解；在缺氧時(shí)，細(xì)胞中的脯氨酰羥基化酶活性降低，HIF-1α不能被分解，于是在細(xì)胞中大量積聚［17］。因此，腎臟中HIF-1α蛋白的表達(dá)水平能夠直接反映腎臟的缺氧情況。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腎臟HIF-1α蛋白表達(dá)水平，DS組相對(duì)于D組和S組明顯升高，U組相對(duì)于DS組明顯降低。這說(shuō)明在糖尿病膿毒癥大鼠腎臟組織中顯著缺氧，而UTI能夠改善腎臟缺氧狀態(tài)，降低HIF-1α表達(dá)，保護(hù)腎臟功能。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建大鼠糖尿病膿毒癥致AKI模型，證實(shí)UTI預(yù)處理能有效改善大鼠的腎功能，減輕AKI，其機(jī)制可能與UTI能夠抑制炎性反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激、改善腎臟缺氧情況有關(guān)。

［1］ LHEVEDER R，NOLAN T.International Diabetes Federation［J］.Diabetes Research and Clinical Practice，2013，101（3）：349-351.

［2］ SCHOR N.Acute renal failure and the sepsis syndrome［J］.Kidney Int，2002，61（2）：764-776.

［3］ 張紅梅，劉培，盛春風(fēng)，等.烏司他丁對(duì)膿毒癥膈肌p38MAPK信號(hào)通路的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（18）：2117-2119.

［4］ 薛霞，肖正大，王淑芳，等.烏司他丁對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，50（1）：1-4.

［5］ 張新杰，劉建坤，高冬梅，等.吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28（10）：1807-1811.

［6］ 李寶貴，王丹丹，解珂，等.黃芪多糖對(duì)2型糖尿病合并膿毒癥大鼠胰腺線粒體氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用［J］.江蘇醫(yī)藥，2011，37（8）：894-896.

［7］ CHENG D.Prevalence，predisposition and prevention of type IIdiabetes［J］.Nutr Metab（Lond），2005，2：29.

［8］ SRINIVASAN K，RAMARAOP.Animal models in type2 diabetes research：an overview［J］.Indian J Med Res，2007，125（3）：451-472.

［9］ REMICK DG，NEWCOMB DE，BOLGOS GL，et al.Comparison of the mortality and inflammatory response of two models of sepsis：lipopolysaccharide vs.cecal ligation and puncture［J］.Shock，2000，13（2）：110-116.

［10］UYANIK A，UNAL D，UYANIK MH，et al.The effects of polymicrobial sepsis with diabetes mellitus on kidney tissues in ovariectomized rats［J］.Ren Fail，2010，32（5）：592-602.

［11］GAO C，HUAN J，LI W，et al.Protective effects of ulinastatin on pancreatic and renal damage in rats following early scald injury［J］.Burns，2009，35（4）：547-552.

［12］YANG Q，LIU X，LIU M，et al.Ulinastatin-mediated protection against zymosan-induced multiple organ dysfunction in rats［J］.Biologicals，2010，38（5）：552-556.

［13］OH SY，KIM JC，CHOIYS，et al.Effects of ulinastatin treatment on myocardial and renal injury in patients undergoing aortic valve replacement with cardiopulmonary bypass［J］.Korean JAnesthesiol，2012，62（2）：148-153.

［14］HUANGN，WANGF，WANGY，et al.Ulinastatin improves survival of septic mice by suppressing inflammatory response and lymphocyte apoptosis［J］.JSurg Res，2013，182（2）：296-302.

［15］PARK KH，LEE KH，KIM H，et al.The Anti-inflammatory effects of ulinastatin in trauma patients with hemorrhagic shock［J］.Journal of Korean Medical Science，2010，25（1）：128.

［16］AOSASA S，ONO S，MOCHIZUKI H，et al.Mechanism of the inhibitory effect of protease inhibitor on tumor necrosis factor alpha production of monocytes［J］.Shock，2001，15（2）：101-105.

［17］FREDE S，BERCHNER-PFANNSCHMIDT U，F(xiàn)ANDREY J.Regulation of hypoxia-inducible factors during inflammation［J］.Meth Enzymol，2007，435：405-419.