王宇，劉菊英，王賢裕，柯昌斌，李瑞明，王曉勛

（十堰市太和醫(yī)院、湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院a.麻醉科，b.生物醫(yī)學(xué)研究所，湖北十堰 442000）

銅／鋅超氧化物歧化酶（Cu／ZnSOD）是一種廣泛存在于真核生物細胞質(zhì)及過氧化物酶體中的大分子蛋白，是機體內(nèi)主要的具有特異性的內(nèi)源性氧自由基清除劑［1］。因此增加細胞內(nèi) Cu／ZnSOD水平有望成為防治缺血再灌注損傷的有力措施之一，但由于Cu／ZnSOD在細胞膜上沒有專一受體或通道，外源性Cu／ZnSOD難以進入細胞和組織內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用，因而限制了其臨床應(yīng)用。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（PTD）是一種能攜帶大分子物質(zhì)無特異性的穿透哺乳動物細胞膜的陽離子小分子多肽［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)可以通過優(yōu)化PTD結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)和表面的電子分布來提高PTD結(jié)構(gòu)的內(nèi)化效率，達到攜帶大分子物質(zhì)高效進入細胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的目的。本研究擬構(gòu)建具有高效穿膜特性的人類PTD4-Cu／ZnSOD原核表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中制備和純化蛋白，并觀察這種PTD4-Cu／ZnSOD融合蛋白穿膜能力，為利用細胞穿透肽攜Cu／ZnSOD治療缺血性疾病的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 PGEM-T載體購自Promaga公司。pET-16b、E.coli BL21（DE3）購于 Novagen公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 PCR儀（EPPENDORF，美國），凝膠數(shù)字圖像分析儀（Alpha ImagerTM2200.Alpha Innotech，美國），基因測序儀（ABI310，美國），電泳儀（MINI-PROTEAN3BIO-RAD，德國）。RobusT?RT-PCR＿kit、限制性內(nèi)切酶：BamHI、XhoI、NdeⅠ、T4連接酶、PfuUltratmhigh-fidelity酶、TAQ酶、Wizaad?SV Gel and PCR Clean-Up System、Wizard?Plus SVminipreps DNA Purification System、DCFH-DA分別購自 Gibicol、Finnzymes、New England、Stratagene、SABC、Promaga、碧云天公司。IPTG購自Duchefa公司。Ni＋2-nitrilotriacetic acid Sepharose superflow購自Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 PTD4多肽跨膜結(jié)構(gòu)域的設(shè)計 根據(jù)PTD多肽跨膜結(jié)構(gòu)域的特點，利用軟件設(shè)計具有高效跨膜活性的蛋白結(jié)構(gòu)域YARAAARQAR（Q）A，并簡并設(shè)計的寡核苷酸序列。在兩端修飾添加Ndel、XhoI限制性內(nèi)切酶位點：5′-T ATG ACC TAT GCG CGT GCG GCA GCG CGT CAG GCT CGT GCC C-3′；5′-TCG AGG GGC ACG AGC CTG ACG CGC TGC CGC ACG CGC ATA GGT CA-3′設(shè)計擴增人 Cu／Zn SOD蛋白全長CDS引物。5′-CCG CTC GAG GCG ACG AAG GCC GTG TGC GTG-3′；5′-CGG GAT CCT ATT ATT GGG CGA TCC CAA TTA C-3′，兩端分別修飾加入限制性內(nèi)切酶XhoI、BamHI酶位點。

1.2.2 Cu／ZnSOD蛋白全長cDNA序列的獲得及鑒定 提取胚胎肝臟組織的總RNA，以其為模板用于Cu／ZnSOD全長 CDs的逆向轉(zhuǎn)錄和擴增。PCR總反應(yīng)體系（20μL）如下：Oligo（dT）15 primer（0.5 mg·L－1）1μL，total RNA sample 1μL，DEPC water補足 12μL，在反應(yīng)體系中加入 dNTP（10 mmol·L－1）2μL，5×Reaction Buffer 4μL，RNase inhibitor（20 U·μL－1）1μL，M-MμlV RT（200 U·μL－1）1μL置于PCR儀中42℃ 1 h。PCR擴增目的片段擴增體系（50μL）如下：10×buffer 5μL，dNTP（10 mmol·L－1）1μL，MgCl2（25 mmol·L－1）5μL，上游引物15μL，下游引物25μL，pfuDNA聚合酶1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，加去離子水至50μL。將上述各組分混合均勻，預(yù)變性94℃3 min、變性94℃30 s、退火68℃ 30 s、延伸72℃ 30 s。經(jīng)過30個循環(huán)后在72℃5 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將獲得的人Cu／ZnSOD蛋白全長CDs片段，加腺嘌呤（A）處理純化后插入PGEMT載體，獲得 PGEM-Cu／ZnSOD（CDs）載體。

1.2.3 pET16b-PTD4-Cu／ZnSOD蛋白原核表達載體的構(gòu)建 用XhoI、BamHI酶切獲得的pGEM-Cu／ZnSOD（CDs）載體，獲得兩端帶有黏性末端的雙鏈全長Cu／ZnSOD CDs片段，同時用同樣的酶對pET-16b空載體進行雙酶切。膠回收兩端帶有黏性末端的線性載體及Cu／ZnSOD全長CDs片段，將其定向插入pET-16b空載體，獲得 pET-Cu／ZnSOD（CDs）原核表達載體。對上述獲得的 pET-Cu／ZnSOD（CDs）原核表達載體進行特異性酶切，并根據(jù)PTD4設(shè)計的兩條簡并寡核苷酸序列進行高特異性退火雜交，獲得人工合成的兩端帶有限制性內(nèi)切酶黏性末端的小片段簡并雙鏈DNA序列，將其插入上述線性載體中，獲得 pET-PTD4-Cu／ZnSOD（CDs）原核表達載體。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET16b-PTD4-Cu／ZnSOD酶切鑒定 選用引物設(shè)計時修飾的所帶有的酶切位點XhoI和 BamHI酶切鑒定正確重組的 PDC315-TRAIL載體。酶切體系如下：10×Buffer 5μL，Plasmid 5μL，100×BSA 1μL，內(nèi)切酶各2μL，加去離子水至總體積50μL，反應(yīng)條件37℃過夜，分別加入1%瓊脂糖凝膠中，在1×TAE中進行電泳，觀察酶切結(jié)果，選取正確的克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司測序鑒定，用 T7、SP6測序引物測序與GENEBANK X02317 CDs比對。

1.2.5 PTD4-Cu／ZnSOD融合蛋白的誘導(dǎo)、表達與純化 將上述原核表達載體導(dǎo)入感受態(tài)E.coli BL21（DE3）中，鋪疊到含氨芐青霉素（100 mg·L－1）的TB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，挑取單個菌落至50 mL含氨芐青霉素（100 mg·L－1）的 LB液體培養(yǎng)液中37℃增擴培養(yǎng)。當細菌生長至OD600為0.6時（大約3 h）加入0.1 mol·L－1IPTG至終濃度1 mmol·L－1，置25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。低溫離心收集細菌，將收集的菌體溶于25 mL結(jié)合緩沖液，然后冰浴超聲破菌，低溫離心收集上清。把上清緩慢通過Ni＋2-親和層析柱，完畢后，靜置1～2 h，使融合蛋白上的His-Tag與層析柱內(nèi)的Ni＋2結(jié)合，再用10倍體積的結(jié)合緩沖液和6倍體積的漂洗緩沖液（60 mmol· L－1imidazole，500 mmol· L－1NaCl，20 mmol·L－1Tris HCl，pH 7.9）分別過柱，洗脫未結(jié)合的其它蛋白，然后用洗脫緩沖液（1 mol·L－1imidazole，500 mmol·L－1NaCl，20 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.9）洗脫蛋白，分別得到 His-Tag-Human Cu／ZnSOD和His-Tag-PTD4-Human Cu／ZnSOD兩種融合蛋白。分別儲存于70℃冰箱內(nèi)用于以下的實驗。

1.2.6 PTD4-Cu／ZnSOD融合蛋白穿膜能力檢測人心肌細胞株購于ATCC。在細胞的培養(yǎng)液中不加任何處理因素（對照組），或分別加入10μmol·L－1的 Cu／ZnSOD（Cu／ZnSOD組）、10μmol·L－1的PTD4-Cu／ZnSOD（PTD4-Cu／ZnSOD 組），孵 育 10 min。免疫組織化學(xué)法檢測融合蛋白穿膜能力：4℃的4%多聚甲醛固定24 h、PBS洗滌后，加入抗His或抗SOD的單克隆抗體，4℃冰箱孵育12 h。PBS洗滌后每孔加入濃度為FITC標記二抗，孵育、洗滌，用 DAPI染色液復(fù)染細胞核，用熒光顯微鏡照相。

2 結(jié)果

2.1 Cu／ZnSOD全長CDs的克隆及序列測定Cu／ZnSOD cDNA上下游引物擴增后，行瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期的482 bp大小的片段（圖1）。

2.2 p ET16b-PTD4-Cu／ZnSOD雙酶切鑒定pET16b表達系統(tǒng)為了便于克隆表達蛋白，設(shè)計有NdeI、XhoI、BamH三個酶切位點，將 hCu／ZnSOD CDs插入XhoI、BamHI兩位點之間，得到pET16b-Cu／ZnSOD原核表達載體。接著把人工設(shè)計合成PTD4的核酸片段插入NdeI、XhoI位點之間，得到pET16b-PTD4-Cu／ZnSOD原核表達載體。Cu／Zn-SOD cDNA序列有 XhoI、BamHI兩個酶切位點，經(jīng)過XhoI、BamHI酶切后，出現(xiàn)預(yù)期的564 bp和5 148 bp的2條帶（圖2）。

圖1 RTPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒酶切電泳

2.3 p ET16b-PTD4-Cu／ZnSOD質(zhì)粒測序結(jié)果將RT-PCR獲得的人 Cu／Zn SOD全長 CDs插入PGEM-T載體中，酶切，選取正確的克隆。用 T7、SP6引物進行正反向測序獲得的序列經(jīng)過軟件對比顯示我們測序的序列與已被登陸的GENBANK“X02317”CDS序列一致（圖3）。

2.4 表達后細菌的蛋白提取物和融合蛋白純化后的SDS Page分析 融合蛋白提取物和融合蛋白純化后 SDS-PAGE（圖4）結(jié)果表明，分別在18.6 kDa和20 kDa出現(xiàn)Cu／ZnSOD和PTD4-Cu／ZnSOD目標表達條帶，顯示目的融合蛋白的表達量在約占宿主總蛋白表達量的46%。圖象顯示洗脫液里含有的純化融合蛋白量，提取后分裝放置在－70℃保存。

圖3 pET16b-PTD4-Cu／ZnSOD原核表達質(zhì)粒測序結(jié)果

圖4 蛋白提取物和融合蛋白純化后的SDS Page分析

2.5 融合蛋白質(zhì)穿膜能力檢測 與對照組和Cu／ZnSOD組比較，PTD4-Cu／ZnSOD組細胞內(nèi)綠色熒光顯著增強。顯示融合蛋白PTD4-Cu／ZnSOD能穿透心肌細胞，分布于胞質(zhì)及胞核中。

3 討論

Gu／ZnSOD是一種廣泛存在于真核生物細胞的細胞質(zhì)、植物的葉綠體及過氧化物酶體中的大分子蛋白，在胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，是機體內(nèi)主要的特異性的內(nèi)源性氧自由基清除劑［4］。在正常情況下，細胞內(nèi)有一定量的表達，以保持機體內(nèi)氧化-還原的穩(wěn)態(tài)。發(fā)生缺血再灌注時，由于氧自由基生成速度遠遠超過的清除能力，導(dǎo)致氧自由基的堆積，從而發(fā)生再灌注損傷。因此增加細胞內(nèi)Gu／ZnSOD的水平則有可能成為防治缺血再灌注損傷的有力措施，但是Gu／ZnSOD在哺乳動物細胞膜上沒有專一受體或通道，所以外源性的Gu／ZnSOD很難進入細胞和組織內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的，由此限制了其在臨床的應(yīng)用。近年研究發(fā)現(xiàn)利用病毒載體、脂質(zhì)體作為載體轉(zhuǎn)染SOD基因?qū)Υ笫笮募∪毖俟嘧p傷有明顯保護作用。但這些方法存在一些關(guān)鍵問題尚未解決，主要包括基因?qū)胄?、基因表達的可控性、安全性等，從而能限制了上述方法在臨床上得應(yīng)用［5］。因此本研究目的是找到一種合適的方法將 Gu／ZnSOD帶入到細胞內(nèi)，為應(yīng)用 Gu／Zn-SOD防治心肌缺血再灌注損傷提供參考。

Green等和Frankel等在1988年首次報道了HIV-1的反式激活蛋白Tat具有跨膜進入細胞的功能［6-7］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Tat蛋白真正具有轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的是其序列中的47～57這11個氨基酸殘基，稱之為PTD。在研究這些序列特征與結(jié)構(gòu)后，Alan等應(yīng)用生物信息學(xué)軟件通過改變結(jié)構(gòu)域中疏水氨基酸和堿性氨基酸的種類和分布、優(yōu)化表面電子分布，得到人工設(shè)計出比TAT-PTD具有更高效率的穿膜活性的PTD分子。與此同時，各國的研究者分別把TAT-PTD、9-Polylysine、以及用生物信息學(xué)軟件設(shè)計的多肽結(jié)構(gòu)引入Human Cu／ZnSOD和其它目的蛋白的透膜實驗，顯示出逐漸增強的穿膜特性［8］。隨后，TAT-PTD介導(dǎo)多種大分子跨膜進入細胞的實驗廣泛開展［9］，對其生物合成過程，融合蛋白的免疫活性，毒性，穿膜效能和靶向治療等進行了深入研究。本研究中，我們設(shè)計并合成一段高效PTD序列用于融合表達的 PTD4-Cu／ZnSOD蛋白［10］，并構(gòu)建 出 pET16b-Cu／ZnSOD 和 pET16b-PTD4-Cu／Zn-SOD兩種原核表達載體。選用pET16b作為原核表達載體，使表達的兩種蛋白的N段含有連續(xù)的10個His標簽融合序列，以便于方便快捷利用Ni＋2柱層析進行純化，方便檢測。兩種載體可以高效地穩(wěn)定表達兩種蛋白，其表達效率可達49%和42%。蛋白以可溶的形式表達，有利于重折疊形成有活性的蛋白，這是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵［11］。已有研究證實正確折疊的TAT-GFP蛋白雖可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)但其熒光強度顯著降低。蛋白使氧自由基的消除的過程中也同樣依賴于過氧化氫酶的作用，PTD-Cu／ZnSOD進入細胞后把氧自由基轉(zhuǎn)化成H2O2，由過氧化氫酶再把H2O2還原為H2O和新生態(tài)氧而轉(zhuǎn)化成O2。因此PTD-Cu／ZnSOD蛋白的活性不僅依賴于蛋白表達時的復(fù)性重折疊，也依賴于細胞內(nèi)過氧化氫酶的含量。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PTD4-Cu／ZnSOD處理的心肌細胞，胞內(nèi)出現(xiàn)高水平的His，由于正常細胞內(nèi)幾乎沒有His結(jié)構(gòu)，說明這種His結(jié)構(gòu)是外源性的PTD4-Cu／ZnSOD導(dǎo)入的，并且PTD4-Cu／ZnSOD處理的細胞內(nèi)SOD水平顯著高于正常心肌細胞，由此可見，我們實驗中構(gòu)建的PTD4-Cu／ZnSOD具有高效的穿透細胞膜的內(nèi)化作用。

綜上所述，本研究依賴于生物信息學(xué)蛋白結(jié)構(gòu)和跨膜蛋白結(jié)構(gòu)的原理設(shè)計合成具有高效穿膜活性的PTD結(jié)構(gòu)和Cu／ZnSOD融合表達，經(jīng)過實驗顯示良好的穿膜特性，進一步提高了PTD分子的內(nèi)化作用，為建立一種高效的PTD分子打下了良好的基礎(chǔ)。而PTD能夠攜帶生物大分子高效進入成活細胞的特性也預(yù)示著其廣闊的應(yīng)用前景，可以把PTD作為一種載體工具，攜帶缺少穿越細胞膜能力的生物大分子高效穿越細胞生物膜來發(fā)揮其生物活性，進行靶向治療。

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