潘 貴，劉建萍

(南昌大學第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江西 南昌 330000)

糖尿病是一組由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島β細胞被破壞或胰島素合成及作用途徑被阻斷所造成血糖異常。長期高血糖狀態(tài)會引發(fā)多種嚴重的并發(fā)癥，如心血管疾病、腎功能衰竭和視網(wǎng)膜病變等。研究[1]顯示：2013年，全球有3.82億成人患糖尿病，到2035年，這一數(shù)字預計達到5.92億，將會給社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔和衛(wèi)生負擔。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一類長度約為22nt的內(nèi)源性非編碼RNA，已被證實參與了許多疾病的發(fā)病過程，包括癌癥、細菌、病毒感染以及糖尿病?？赏ㄟ^靶向miRNA 或阻止其翻譯相關蛋白來抑制基因的表達。miRNA是哺乳動物基因組中最為豐富的調(diào)節(jié)基因之一，在細胞發(fā)育中起重要作用[2]。miRNA是葡萄糖動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)器，在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程中起關鍵作用，對胰島素分泌和胰島素抵抗有一定的調(diào)節(jié)作用，同時對胰島β細胞的分化和再生以及胰島的發(fā)育有重要的調(diào)控作用[3-5]。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，可受遺傳和環(huán)境等多重復雜因素的影響，以胰島β細胞的死亡為其主要的病理特征，但目前對于1型糖尿病的發(fā)病機制尚未清楚，miRNA可能成為解決這一難題突破口[6-7]。近年來，國內(nèi)外研究者越來越多地將目光聚焦在研究干細胞治療糖尿病的方法上。干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，干細胞可以分化成多種功能細胞，多位學者已經(jīng)成功地將各種來源的干細胞分化成有功能的胰島素分泌細胞(insulin producing cells,IPCs)。目前可用于β細胞替代治療的干細胞來源主要有胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)、誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)以及成體干細胞[8]。既往對miRNA在糖尿病發(fā)展過程中的作用機制研究較多，但在各類干細胞分化成胰島素分泌細胞過程中miRNA的表達情況尚未見綜述報道，本文主要對miRNA在各種來源的干細胞向IPCs分化過程中的表達情況進行綜述。

1 ESCs向IPCs分化過程中關鍵miRNA的表達

ESCs是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境中，ESCs均能被誘導分化為機體內(nèi)幾乎所有的細胞類型，在特定的體外培養(yǎng)環(huán)境下其可以被誘導成IPCs[9]。Sulzbacher等[10]通過激活素A的誘導作用成功地將ESCs轉(zhuǎn)化成內(nèi)胚層和胰腺細胞。Wei等[11]在將ESCs誘導成IPCs的過程中，發(fā)現(xiàn)miR-375和miR-7的動態(tài)表達模式與人胎兒胰腺發(fā)育過程中的動態(tài)表達模式相似，而miR-146a和miR-34a的動態(tài)表達則顯示出特異性W模式。miR-375和miR-7的預測靶基因Hnf1β和Pax6的表達與miR-375和miR-7的表達呈負相關關系，miR-375的過表達可以下調(diào)腸內(nèi)皮細胞/胰腺祖細胞(pancreatic progenitor cells,PPCs)特異性標記基因Hnf1β和Sox9的表達，miR-375表達水平的升高和降低對于胰島細胞的產(chǎn)生和成熟功能非常重要。在miR-34a表達水平最低的第6天和第10天，PPCs分別開始被誘導和誘導成功，而在miR-146a表達水平最低的第14和19天，出現(xiàn)表達內(nèi)分泌激素的細胞和接近分化末端的細胞，說明miR-34a和miR-146a可能分別在PPCs形成過程和PPCs分化成IPCs過程中起作用。因此，miRNA可以直接或間接調(diào)節(jié)胰島細胞器官發(fā)生特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達，以控制胰島細胞的分化和成熟。研究[12]顯示：用含有人miR-375前體的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人胚胎干細胞(hESCs)，miR-375表達穩(wěn)定且明顯，在實驗最后階段聚集形成的人類胚狀體表現(xiàn)出與成熟胰島相似的特征，表明miR-375轉(zhuǎn)染hESCs后向胰腺譜系分化的可行性。Guay等[13]發(fā)現(xiàn)：miR-375在胰腺α細胞中發(fā)揮更重要的作用。在miR-375被敲除的動物中α細胞數(shù)量和胰高血糖素水平升高，從而導致慢性高血糖癥，因此在將ESCs轉(zhuǎn)分化成IPCs的過程中，miRNA的表達至關重要，通過有效調(diào)節(jié)與IPCs形成密切相關的miRNA的表達可以優(yōu)化轉(zhuǎn)分化方案，提高轉(zhuǎn)分化效率。

2 iPSCs向IPCs分化過程中關鍵miRNA表達

iPSCs是通過基因轉(zhuǎn)染技術使體細胞直接重構(gòu)成為ESCs樣的多潛能細胞。多位研究者[14]已成功地將iPSCs誘導分化成IPCs。Alipio等[15]利用iPSCs成功地誘導出類似于小鼠內(nèi)源性IPCs的β樣細胞，這些β樣細胞在葡萄糖刺激下分泌胰島素，并通過iPSCs移植來改善1型和2型糖尿病小鼠模型的高血糖表型。Sebastiani等[16]在將iPSCs誘導成IPCs過程中觀察到大量miRNA的差異表達，其中11個miRNA表達水平上調(diào)(miR-9-5p、miR-9-3p、miR-10a、miR-99a-3p、miR-124a、miR-135a、miR-138、miR-149、miR-211、miR-342-3p和miR-375)，7個miRNA表達水平下調(diào)(miR-31、miR-127、miR-143、miR-302c-3p、miR-373、miR-518b和miR-520c-3p)，這些miRNA調(diào)控參與胰腺發(fā)育過程或內(nèi)分泌胰腺細胞命運的特異性靶基因。Shaer等[17]使用轉(zhuǎn)染試劑將hsa-microRNA-7轉(zhuǎn)染至人源性多能干細胞集落，化學轉(zhuǎn)染后觀察到細胞形態(tài)表現(xiàn)發(fā)生變化，并形成了細胞簇，胰腺特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達水平在第1天升高，在第2天明顯升高，證實了胰島素和Ngn3蛋白的存在，從而證實miR-7轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡在胰腺發(fā)育過程中起重要作用,采用miR-7進行化學轉(zhuǎn)染可以在短時間內(nèi)將人iPSCs分化成胰島樣功能細胞簇。Shaer等[18]通過實驗也證實了miR-186和miR-375的過表達在短時間內(nèi)可將人iPSCs分化成胰島樣細胞簇，并使胰島發(fā)育相關基因(Pdx1、Pax4、Pax6、Kir6.2和Nkx6.1等)表達水平升高,表明miR-186和miR-375的過表達可能是誘導胰島樣細胞簇形成的替代方案。

3 成體干細胞向IPCs分化過程中關鍵miRNA表達

成體干細胞是成體組織中保留的未分化完全的原始細胞，存在于體內(nèi)各個臟器中，在一定條件下，成體干細胞可以跨越傳統(tǒng)胚層概念的界限，分化成其他胚層的干細胞。目前研究較多的主要有肝干細胞、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和胰腺干細胞。

3.1 肝干細胞 腹側(cè)胰腺和肝臟具有共同的發(fā)育起源，均來源于內(nèi)胚層，二者中均有血糖濃度的變化。在一定條件下可以將肝干細胞成功的誘導成IPCs[19-22]。Lu等[23]采用miR-302類似物和表達Pdx1、Ngn3和MafA的質(zhì)粒感染人類肝細胞系HL-7702，通過28 d的誘導方案對肝細胞進行誘導，過表達miR-302a 可增加胰腺發(fā)育相關基因Sox9、Foxa2和內(nèi)生性Pdx1 的表達，最終獲得能分泌胰島素的細胞，其在體外能夠?qū)ι硇匝菨舛鹊淖兓龀龇磻⑨尫乓葝u素，這表明miR-302的參與可能在肝細胞轉(zhuǎn)化成胰島樣細胞過程中發(fā)揮關鍵的調(diào)節(jié)作用。由于肝細胞的來源特殊，如果能發(fā)現(xiàn)肝干細胞向IPCs分化過程中起關鍵作用的miRNA，探索出更加優(yōu)化的誘導方案，將對糖尿病的治療起至關重要的作用。

3.2 MSCs MSCs是一類存在于多種組織(如骨髓、臍帶血、臍帶組織、胎盤組織和脂肪組織等)、具有多向分化潛力、非造血干細胞的成體干細胞[24]。已有多位學者[25-26]成功將MSCs誘導為IPCs。miR-375是胰島組織特異表達的miRNA，不僅能參與胰島素的分泌過程，而且與胰島素的合成過程也密切相關。Bai等[27]發(fā)現(xiàn)：miR-375可通過抑制靶基因Mtpn和Sox6來誘導臍帶間充質(zhì)細胞(N-UCMSCs)分化為IPCs。肌營養(yǎng)不良蛋白是Mtpn的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在β細胞根據(jù)血糖變化釋放胰島素的過程中起重要作用,通過敲除Mtpn可以模擬miR-375過表達對胰島素分泌的影響[28]。在小鼠體內(nèi)過表達miR-26a不僅能增加出生后胰島細胞數(shù)量，同時在體外也能增加內(nèi)分泌/腺泡集落[29]。miR-26a通過靶向Sox6、Ccnd1和Bhlhe22來誘導IPCs的形成，miR-26a和miR-375共同作用能夠誘導MSCs到IPCs的交叉胚層分化[27]。Piran等[30]用含miR-375的慢病毒轉(zhuǎn)染從糖尿病患者的脂肪組織中提取的脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose tissue derived stromal cells,ADSCs)，在經(jīng)過一系列的誘導過程后，形成的胰島樣細胞簇特異性基因包括insulin和Pdx1以及基因相對應的蛋白表達水平明顯升高，說明過表達miR-375可以使ADSCs轉(zhuǎn)化成胰島樣細胞簇。Hlxb9基因在成人胰腺中表達明顯，在IPCs分化期間發(fā)揮關鍵作用。Mu等[31]發(fā)現(xiàn)：在骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)向IPCs分化過程中，miR-200a和miR-141可以通過結(jié)合Hlxb9基因的mRNA 30UTR來抑制Hlxb9基因的表達。 miR-200a和miR-141的過表達可下調(diào)PPCs標志物Hlxb9和Pdx1的表達。因此，miR-200a和miR-141可以直接或間接調(diào)節(jié)胰島轉(zhuǎn)錄因子的表達以控制IPCs的分化。Jafarian等[32]發(fā)現(xiàn)：miR-375和抗miR-9的協(xié)同作用可以將人MSCs誘導分化成胰島樣細胞簇，這些發(fā)現(xiàn)突出了miRNA在干細胞分化過程中的作用，表明miRNA可以作為糖尿病基因治療的工具。

3.3 胰腺干細胞 成年胰腺中存在著干細胞，胰腺干細胞能分化形成胰腺導管、胰島和胰腺外分泌腺腺泡等特定的胰腺組織細胞，是具有多向分化能力和自我更新的未分化細胞。由于胰腺干細胞缺乏特異性的分子標志，其分離和純化還存在著一定的困難[33]。Bai等[34]為了研究miR-21在PPCs向IPCs分化過程中的調(diào)節(jié)作用，分別過表達和抑制了miR-21，并在PPCs中表達miR-21靶基因的小干擾RNA。小干擾RNA被用來敲除miR-21在PPCs中靶基因，以闡明這些基因在IPCs形成過程中的作用，miR-21通過調(diào)節(jié)靶基因和下游基因(Sox6、Rpbj和Hes1)的表達成為IPCs形成的雙向開關，說明內(nèi)源性miRNA在IPCs的形成過程中起重要調(diào)節(jié)作用。

4 展 望

miRNA在基因表達和調(diào)控方面的重要作用已經(jīng)得到了充分的證實，且已經(jīng)被廣泛地運用于人類生理和疾病方面的研究。在胰腺的發(fā)育過程中，miRNA調(diào)控多種胰腺發(fā)育相關的特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達，同時，這些轉(zhuǎn)錄因子又反過來調(diào)控miRNA，構(gòu)成了復雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡，在胰腺形成過程中起重要作用。在各種干細胞定向分化的過程中，可通過過表達或抑制某些miRNA來調(diào)節(jié)和改變干細胞既定的分化方向，朝著胰腺形成的過程分化，最終獲得可以有效分泌胰島素的胰腺β細胞，為糖尿病治療提供一種新的手段和策略。因此，對于miRNA在干細胞向IPCs分化、成熟及胰島素分泌過程中的作用進行深入的研究，不僅有助于闡明IPCs分化過程的分子機制，建立將各種干細胞分化成IPCs的新策略，同時也有助于探索獲得能分泌足夠胰島素的IPCs，為糖尿病的改善和治療提供新的方法和思路。

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