韓曉群，林劍國，楊婧

肝纖維化是因膠原纖維生成和溶解失衡造成的大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積在肝臟內(nèi)形成瘢痕組織的過程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要事件。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功能，并具有抗纖維化作用，目前對HSCs機制的研究主要集中在抑制HSCs增殖、誘導(dǎo)HSCs凋亡等方面[1-3]。本研究聚焦于姜黃素能否通過調(diào)節(jié)HSCs脂質(zhì)水平抑制HSCs活化，從而發(fā)揮其抗纖維化作用機制，希望通過探討姜黃素對活化HSCs脂質(zhì)水平的影響及其可能機制，為臨床抗纖維化治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 姜黃素、油紅O染色試劑盒、TRI試劑購自美國Sigma公司；甘油三酯(triglyceride，TG)和游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)ELISA試劑盒購于中生北控生物科技有限公司；高效RNA-cDNA 試劑盒購于美國Applied Biosystems公司；2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix購于上海欣百諾公司。

1.2 小鼠HSCs的分離、鑒定、培養(yǎng)及藥物干預(yù)C57/B6小鼠購于武漢大學(xué)實驗動物中心。向小鼠門靜脈灌注鏈霉蛋白酶和膠原酶，采用梯度離心法分離HSCs。將分離所得HSCs以含20%胎牛血清(FBS)的DMEM懸浮，臺盼藍(lán)法計算細(xì)胞數(shù)及存活率。在倒置顯微鏡下觀察，新分離的HSCs在培養(yǎng)液中懸浮，呈球形，折光性強。熒光顯微鏡下觀察，新分離的HSCs在328nm紫外光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)綠色的自發(fā)熒光。細(xì)胞以1×106/cm2密度接種于6孔培養(yǎng)板，48h后純度大于95%；3d后以含10% FBS的DMEM常規(guī)傳代培養(yǎng)。取第4～9代細(xì)胞用于實驗。同時常規(guī)培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞AML12，作為對照。實驗前以不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)HSCs或AML12細(xì)胞24h后，再采用凋亡抑制因子存活素(survivin，1nmol/L)預(yù)處理細(xì)胞24h，之后分別以濃度為5、10、20μmol/L姜黃素干預(yù)細(xì)胞24h。

1.3 HSCs內(nèi)脂滴的觀察 采用油紅O染色法。將油紅O溶于60%異丙醇，以4%甲醛固定細(xì)胞15min，加入油紅O溶液染色10min，60%異丙醇漂洗2min除去多余染料，蘇木素復(fù)染，40倍顯微鏡下觀察HSCs內(nèi)脂滴。靜止?fàn)顟B(tài)下HSCs內(nèi)脂滴油紅O染色呈暗紅色。

1.4 ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)TG和FFA含量 按照TG或FFA檢測試劑盒說明書，采用ELISA方法檢測細(xì)胞內(nèi)的TG和FFA含量。

1.5 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的檢測 采用RTqPCR檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達。使用TRI試劑提取HSCs細(xì)胞總RNA，用高效RNA-cDNA 試劑盒合成第一條互補DNA鏈；用2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)、自水解酶域包含蛋白5(abhydrolase domain containing 5，abhd5)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)的mRNA水平。引物序列如表1所示。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2–ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences in real-time PCR

1.6 脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的Western blotting檢測收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白，按常規(guī)操作進行SREBP1c、FAS、abdh5、ATGL的Western blotting檢測，蛋白條帶通過化學(xué)發(fā)光顯影，目標(biāo)蛋白表達量通過β-actin進行校正。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用Oneway ANOVA分析，進一步兩兩比較采用post hoc檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對HSCs內(nèi)脂滴的影響 以5、10、20μmol/L姜黃素干預(yù)活化HSCs和AML12細(xì)胞后，鏡下可見隨著姜黃素濃度增加，HSCs內(nèi)暗紅色脂滴數(shù)量逐漸增多，表明姜黃素可恢復(fù)小鼠HSCs內(nèi)脂滴水平，作用呈劑量依賴性；而姜黃素對AML12細(xì)胞內(nèi)脂滴無明顯影響(圖1)。

圖1 姜黃素對肝星狀細(xì)胞內(nèi)脂滴水平的影響(×40)Fig.1 Effect of curcumin on HSCs' lipid droplet levels (×40)

2.2 姜黃素對小鼠HSCs脂質(zhì)水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，采用5、10、20μmol/L濃度姜黃素干預(yù)細(xì)胞后，小鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)TG含量[分別為(1.495±0.230)nmol/mg protein、(3.758±0.717)nmol/mg protein、(4.490±0.360)nmol/mg protein]與對照組[(1.176±0.343)nmol/mg protein]比較明顯升高(P＜0.01)；FFA含量[分別為(57.250±1.463)nmol/mg protein、(78.425±1.030)nmol/mg protein、(111.150±2.350)nmol/mg protein]與對照組[(28.750±2.433)nmol/mg protein]比較明顯升高(P＜0.01)，且作用呈劑量依賴性。使用凋亡抑制因子survivin抑制細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞內(nèi)TG和FFA含量與未使用survinvin時比較無明顯變化(圖2)。

圖2 姜黃素對肝星狀細(xì)胞甘油三酯和游離脂肪酸的影響(n=3)Fig.2 Effects of curcumin on TG and FFA levels in HSCs (n=3)

2.3 姜黃素對小鼠肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA及蛋白表達的影響 RT-qPCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，姜黃素明顯上調(diào)了FAS和SREBP-1c基因的mRNA和蛋白的表達(P＜0.01)，明顯下調(diào)了ATGL基因及蛋白的表達(P＜0.05)，但對abhd5基因表達無明顯影響(P＞0.05，圖3)。

圖3 姜黃素對肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1C、FAS、ATGL、abhd5表達的影響(n=3)Fig.3 Effects of curcumin on the expression of genes related to the lipid metabolism of activated HSCs (n=3)

3 討 論

研究表明，盡管不同原因?qū)е碌母闻K疾病表現(xiàn)出不同的病理變化，但HSCs活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要事件和共同途徑，是肝纖維化的細(xì)胞基礎(chǔ)。HSCs胞質(zhì)內(nèi)的脂滴并非細(xì)胞內(nèi)一個簡單的能量貯存器，而是一個復(fù)雜、活動旺盛、動態(tài)變化的多功能細(xì)胞器，它參與了脂類代謝與存儲、膜轉(zhuǎn)運、蛋白降解，以及某些信號傳導(dǎo)。多種代謝性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病，往往都伴隨著脂滴的異常[4]。肝臟損傷過程中，靜止的HSCs發(fā)生明顯的表型變化，包括細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失及α-平滑肌肌動蛋白的重新表達、細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積等，這一過程即為HSCs活化。激活的HSCs通過增生和分泌過多的細(xì)胞外基質(zhì)引起肝纖維化的形成。鑒于此，從抑制HSCs活性入手來減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生已成為目前治療肝纖維化的研究熱點[5]。HSCs脂滴消失是細(xì)胞活化的特征之一，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集能夠有效抑制HSCs的活化[6]。

細(xì)胞脂滴內(nèi)脂肪的來源除從細(xì)胞外攝入與轉(zhuǎn)運外，主要依賴內(nèi)源性的脂肪合成。肝臟脂肪生成在轉(zhuǎn)錄水平受到一系列調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控，這些調(diào)節(jié)蛋白包括SREBP-1c、過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)等。SREBP-1是SREBP家族成員之一，SREBP-1有兩種亞型，即SREBP-1a和SREBP-1c；在肝臟中SREBP-1a和SREBP-1c的mRNA表達比例為1:9，在HSCs中其比例為1:4；SREBP-1a主要促進脂肪酸和膽固醇的合成，而SREBP-1c則在甘油三酯和磷脂形成中發(fā)揮重要作用[7]。有研究表明，地骨皮甲素能夠通過下調(diào)SREBP-1c 的表達而抑制脂肪肝的形成[8]；而Lee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-1能夠調(diào)節(jié)FAS、硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(stearyl coenzyme A desaturase -1，SCD-1)、乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1)等促進FFA及TG合成的基因表達，發(fā)揮促進HSCs脂滴堆積的作用。

另外，脂質(zhì)分解在維持脂質(zhì)平衡方面的作用亦不容忽視。脂質(zhì)分解受ATGL、激素敏感性脂肪酶及單酰基甘油酯酶調(diào)節(jié)，其中ATGL是脂肪分解的限速酶。AGTL活化須與abhd5相關(guān)聯(lián)活化后才能發(fā)揮催化作用。abhd5是ATGL的輔助活化因子，協(xié)助ATGL催化TG分解生成甘油二酯和FFA[10]。ATGL和abdh5之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系被打破，或任何一方發(fā)生突變都會影響ATGL的活性，從而導(dǎo)致異位脂質(zhì)堆積。

在正常肝組織內(nèi)，HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞內(nèi)存在大量脂滴；而在纖維化過程中，HSCs激活，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)的同時，細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失[6,11]。有研究表明，激活的HSCs內(nèi)恢復(fù)脂滴形成后，細(xì)胞就會返回到靜止?fàn)顟B(tài)，并明顯抑制產(chǎn)生膠原蛋白的能力[12]。

本研究采用不同濃度的姜黃素對HSCs進行干預(yù)，結(jié)果顯示，姜黃素呈劑量依賴地增加了HSCs內(nèi)脂滴形成及脂肪水平，但對肝細(xì)胞AML12內(nèi)脂肪水平?jīng)]有影響，說明姜黃素只對HSCs起作用；進一步針對脂質(zhì)代謝相關(guān)分子的研究表明，姜黃素通過增加脂肪的合成及抑制脂肪的分解來達到積累脂肪的目的。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素在一定濃度下可抑制HSCs的增殖，并促進其凋亡。為證實HSCs細(xì)胞內(nèi)脂滴的變化不是HSCs促進凋亡的結(jié)果，本研究采用凋亡抑制因子survivin(1nmol/L)處理細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)姜黃素的作用受到明顯影響，表明恢復(fù)HSCs脂質(zhì)水平可能是姜黃素抑制HSCs活化的機制之一。

另有研究證實，姜黃素可通過調(diào)節(jié)瘦素及瘦素受體表達而在抗肝臟脂肪變性及抗肝纖維化中發(fā)揮作用[13-14]，但其通過調(diào)節(jié)HSCs內(nèi)脂滴水平發(fā)揮抗纖維化的作用是否與瘦素受體相關(guān)，尚須進一步研究。

綜上所述，姜黃素可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達促進HSCs脂滴堆積，且對肝實質(zhì)細(xì)胞脂滴水平無明顯影響，提示姜黃素在肝纖維化的治療中具有一定的應(yīng)用潛力。