鄭文駿，毛智翔，黃琳娟 綜述，姚 軍，錢翠娟 審校

(臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院：1.臨床醫(yī)學(xué)系；2.醫(yī)學(xué)檢驗教研室；3.臨床醫(yī)學(xué)教研室，浙江臺州 318000)

胰蛋白酶是胰腺分泌后活化的一種酶，可以選擇性地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，進而分解為氨基酸?？茖W(xué)家們在豆類、谷類、油料作物等植物中發(fā)現(xiàn)了多種胰蛋白酶抑制劑。其中，植物來源的胰蛋白酶抑制劑具有相對分子質(zhì)量較小、免疫反應(yīng)較弱、原料來源廣及價格低廉等優(yōu)點，受到研究者的關(guān)注。目前，臨床上胰蛋白酶抑制劑已用于治療急性胰腺炎、防治腦缺血和腦水腫、抑制宮縮及預(yù)防早產(chǎn)等，并且取得了很好的效果[1]。已有的體外研究結(jié)果表明，存在于豆類植物中的Bowman-Birk型(BBI)和Kunitz型(KTI)胰蛋白酶抑制劑能夠通過抑制癌細胞增殖、黏附、遷移與侵襲，或促進癌細胞凋亡等方式抑制腫瘤細胞的生長，最終抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。此外，胰蛋白酶抑制劑可以與多西他塞、多西紫杉醇、環(huán)磷酰胺等多種抗癌藥物聯(lián)合使用，通過增強化療藥物的療效或者減少化療藥物的耐藥，取得更優(yōu)的抗腫瘤效果[2]。但是，胰蛋白酶抑制劑仍尚未應(yīng)用于臨床腫瘤的治療。因此，在腫瘤的分子靶向治療的研究中，胰蛋白酶抑制劑一直是目前研究的熱點。

1 胰蛋白酶抑制劑的基本特征

胰蛋白酶抑制劑是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在人體、動物和植物中都有分布，主要功能是抑制胰蛋白酶的分泌[1-2]。多數(shù)已開發(fā)的胰蛋白酶抑制劑來源于人和動物，如從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑、從牛肺或牛胰中提取的抑肽酶等。但是，這類胰蛋白酶抑制劑易受到病原微生物(如病毒等)的污染，且相對分子質(zhì)量較大，可引起過敏反應(yīng)等。另一些植物來源的胰蛋白酶抑制劑在自然界的含量豐富，活性明確，且相對分子質(zhì)量較小，所以受到越來越多科研工作者的青睞，如從黃豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制劑、從南瓜籽中提取的南瓜胰蛋白酶抑制劑等[1-2]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，通常將來源于豆類中的胰蛋白酶抑制劑分為兩大類，即KTI和BBI[3]。

1.1KTI KTI是在1945年首次從大豆中分離結(jié)晶出來而命名的[3]，它是一種單體蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量在20 kDa左右，由181個氨基酸和2對二硫鍵組成，同時具有由幾個半胱氨酸殘基形成的1對或2對分子內(nèi)二硫鍵所保持的高度保守的N-末端區(qū)域和結(jié)構(gòu)，呈易變的非螺旋形，對熱不穩(wěn)定[4]。分子內(nèi)只有1個活性中心，其活性中心位于第63號的精氨酸和第64號的異亮氨酸上，主要對胰蛋白酶直接地、專一地起作用[5]。KTI屬單頭抑制劑，即一個抑制劑分子只結(jié)合一分子胰蛋白酶。

1.2BBI BBI是由Bowman在1944年作為丙酮不溶因子從大豆中分離出來的，Birk又于1961年成功純化并定義BBI；BBI也是一種單體蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量在8 kDa左右，是由71個氨基酸組成的單肽鏈，含有7個二硫鍵和大量的半胱氨酸，具有熱穩(wěn)定性[6]。2個BBI結(jié)構(gòu)域由保守的二硫鍵保持，每個結(jié)構(gòu)域攜帶一個活性位點，在2個不同活性位點上具有2個獨立的結(jié)合中心，即胰蛋白酶結(jié)合中心(第16號的賴氨酸，第17號的絲氨酸)和胰凝乳蛋白酶結(jié)合中心(第44號的亮氨酸，第45號的絲氨酸)，分別用于抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[7]。

2 胰蛋白酶抑制劑的抗腫瘤作用

胰蛋白酶抑制劑在腫瘤中的研究仍集中在體外研究中，尚未見到胰蛋白酶抑制劑應(yīng)用于人體內(nèi)腫瘤的治療的報道。目前的體外研究表明，胰蛋白酶抑制劑的抗腫瘤作用主要通過調(diào)控細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、或抑制腫瘤細胞侵襲等實現(xiàn)的[6]。

2.1胰蛋白酶抑制劑的抗細胞增殖作用 現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，胰蛋白酶抑制劑能夠抑制多種腫瘤細胞如人結(jié)腸癌細胞、人白血病細胞、人乳腺癌細胞、人卵巢癌細胞、舌癌細胞的生長和增殖[8-13]。

有研究者最早在番薯根中發(fā)現(xiàn)并提取出胰蛋白酶抑制劑[14]。研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶抑制劑能誘導(dǎo)人早幼粒白血病細胞NB4出現(xiàn)細胞周期阻滯，從而抑制細胞的增殖[9]。其中一種在番薯根中提取的主要儲存蛋白被命名為Sporamin，Sporamin占番薯根中總蛋白的80%，屬于KTI[15]。有研究表明，Sporamin能夠通過抑制Akt/GSK-3信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制體外培養(yǎng)的人舌癌細胞的生長和增殖，并且這種作用具有一定的濃度依賴和時間依賴性[16]。而且，Sporamin也能夠抑制體外培養(yǎng)的胰腺癌細胞的生長和增殖，這種作用可能與Notch4蛋白的表達下調(diào)有關(guān)[16]。

另一種類型的胰蛋白酶抑制劑BBI能夠通過上調(diào)腫瘤抑制因子-連接蛋白43(Cx43)的表達而抑制骨肉瘤細胞的增殖[17]。此外，BBI通過下調(diào)細胞周期蛋白D1、E1和ERK1/2的磷酸化及上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達誘導(dǎo)人乳腺癌細胞MCF-7在G1/S期出現(xiàn)細胞周期停滯，且這可能與BBI對泛素-蛋白酶體機制的抑制有關(guān)[11]。另一種從豇豆種子里純化而來的黑眼豌豆胰蛋白酶/糜蛋白酶抑制劑(BTCI)則是通過抑制VEGF分泌來抑制胃癌AGS細胞及結(jié)腸癌HT-29細胞增殖[18]。

2.2胰蛋白酶抑制劑的促凋亡作用 胰蛋白酶抑制劑在細胞凋亡方面也發(fā)揮了顯著的作用，目前已發(fā)現(xiàn)，不同的胰蛋白酶抑制劑分別對肝癌細胞、人白血病細胞、乳腺癌細胞、人結(jié)腸癌細胞、人肺癌細胞等發(fā)揮促凋亡作用，其中誘導(dǎo)細胞凋亡最主要的途徑就是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族的級聯(lián)反應(yīng)[19-23]。

一種來源于蕎麥并經(jīng)過重組的胰蛋白酶抑制劑rBTI能通過促進線粒體中細胞色素C的釋放誘導(dǎo)肝癌細胞H22的凋亡，同時對正常的7702細胞僅有很小的作用[19]。紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑通過Fas與其配體結(jié)合反應(yīng)激活Caspase-8，產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細胞的凋亡[9]。BTCI能引起線粒體膜透化、溶酶體膜透化和DNA斷裂導(dǎo)致乳腺癌細胞的凋亡[11]。

胰蛋白酶抑制劑還能通過影響轉(zhuǎn)錄因子來促進癌細胞的凋亡。在結(jié)腸癌細胞中存在一種過表達的高度保守的核蛋白高遷移率族蛋白1(HMGB1)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這種蛋白與結(jié)腸癌的進展關(guān)系密切[24]。尿胰蛋白酶抑制劑烏司他丁能抑制HMGB1的表達，同時增加NF-κB活性導(dǎo)致其靶基因產(chǎn)物c-IAP2的過表達來達到促進細胞凋亡的作用[22]，同時還能抑制Caspase-9和Caspase-3的活性[25]。另外一種新型經(jīng)苦瓜提取的生物活性肽BG-4表現(xiàn)出顯著的胰蛋白酶抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)，BG-4能通過上調(diào)Bax蛋白的表達并下調(diào)X連鎖凋亡抑制蛋白的表達，從而促進結(jié)腸癌細胞的凋亡[26]。

2.3胰蛋白酶抑制劑的抗侵襲作用 腫瘤的侵襲能力主要體現(xiàn)在細胞外基質(zhì)的降解、血管淋巴管的生成、上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面，而胰蛋白酶抑制劑能通過影響這些過程來達到抗侵襲的作用。

Bikunin也是一種KTI。一方面，Bikunin能通過抑制胞外鈣離子內(nèi)流，來抑制轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1介導(dǎo)的ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及Src酪氨酸激酶的活化，從而導(dǎo)致HRA細胞中PA系統(tǒng)的抑制[27]。另一方面，妊娠相關(guān)血漿蛋白-A基因與MT-SP1基因可能分別作為Bikunin處理后的早期反應(yīng)基因與晚期反應(yīng)基因，而二者都與癌細胞的侵襲相關(guān)[28]。此外，BBI能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌和活性，來阻礙癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時可以明顯地降低VEGF的產(chǎn)生和分泌，從而抑制腫瘤的血管生成[18]。

胰蛋白酶抑制劑EcTI則是通過抑制胃癌細胞整合素-β1的表達，造成了Src-FAK通路受阻，進而阻止Cortactin上主要的Src磷酸化位點發(fā)生酪氨酸磷酸化，使細胞偽足無法形成，抑制細胞的黏和侵襲作用[29]。此外，EcTI可通過抑制MMP-9、MMP-12、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)等抑制腫瘤細胞侵襲作用[30]。

3 胰蛋白酶抑制劑的應(yīng)用

烏司他丁現(xiàn)與多種抗癌藥合用，來增強其藥效。烏司他丁與多西他塞通過抑制血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，二者具有協(xié)同作用[31]。此外，有研究表明,烏司他丁和環(huán)磷酰胺處理小鼠異種移植乳腺癌細胞MCF-7，兩者都能有效抑制癌細胞中CXCR4和MMP-9的表達，且二者具有協(xié)同作用[16]。同時烏司他丁也能增強多西紫杉醇的抗癌作用[5]，不過烏司他丁增強多西紫杉醇的抗癌作用的機制還不清楚。

除了與其他抗癌藥物合用之外，還可以通過胰蛋白酶抑制劑與功能型多肽重組來進行抗腫瘤治療。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是一種在癌細胞的細胞膜上表達，且在正常細胞不表達的蛋白質(zhì)[32]。因此，通過GRP78來行抗腫瘤治療是可行的。而綠豆胰蛋白酶抑制劑(mTI)是一種經(jīng)綠豆提取的胰蛋白酶抑制劑，研究表明，通過GRP78的結(jié)合肽WIFPWIQL與mTI的融合形成重組蛋白GBP-TI，GBP-TI能通過GBP與GRP78的結(jié)合顯著提高其入胞的能力，再通過mTI的抗癌作用對結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生特異且強大的生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，該重組過程不影響二者酶活性，且能顯著增強其抗癌作用[33]。

4 小 結(jié)

在不同的腫瘤中胰蛋白酶抑制劑具有不同的表達趨勢，目前胰蛋白酶抑制劑在腫瘤細胞中的效應(yīng)還未完全明確，其在腫瘤中發(fā)揮的作用機制還需要更深入的研究。同時，對胰蛋白酶抑制劑的研究還只停留在細胞、動物試驗的層面，胰蛋白酶抑制劑在早期癌癥臨床治療、聯(lián)合用藥及預(yù)后等方面的作用也需要更深入的研究。