程凱慧,沈付嬈,鄒積振,朱 彤,苗自利,張 亮,解曉莉,楊宏軍,何洪彬

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心,山東 濟(jì)南 250131;2.山東省威海市文登區(qū)宋村畜牧獸醫(yī)工作站,山東 威海 264400)

牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus-BCoV)引起的牛的一種致病性傳染病,在牛群中廣泛傳播,牛感染后主要引起犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道感染三種臨床癥狀。血清學(xué)調(diào)查表明,牛冠狀病毒在牛場中普遍存在,主要通過糞口感染和呼吸道氣溶膠傳播,一旦暴發(fā)此病則很難控制,給以集約化飼養(yǎng)為特點(diǎn)的養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而,目前滅活疫苗和減毒活疫苗的效果不夠理想,臨床上還沒有有效的治療冠狀病毒病的藥物[1-2],因此研制BCoV新型疫苗預(yù)防本病是當(dāng)前面臨的重大挑戰(zhàn),也是今后研究的主要方向。

表位疫苗是以抗原表位為基礎(chǔ)制備的疫苗,是近幾年來新興發(fā)展的一種疫苗研制技術(shù)。該疫苗在臨床應(yīng)用中相對傳統(tǒng)疫苗具有很大的優(yōu)勢：一是表位疫苗本身無毒、穩(wěn)定;二是誘發(fā)的免疫應(yīng)答針對性強(qiáng);三是易于生產(chǎn)、儲藏和使用,符合未來疫苗發(fā)展的方向[3]。牛冠狀病毒的分子生物學(xué)分析表明,BCoV由5種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成,分別為核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、纖突蛋白(S)、小衣殼蛋白和血凝素酯酶蛋白(HE)。其中S蛋白包含主要的抗原位點(diǎn),主要負(fù)責(zé)病毒的吸附、與受體的膜融合及誘導(dǎo)中和抗體[4-5]。因此,可以選擇能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫反應(yīng)的S蛋白抗原表位片段作為診斷抗原,或者重新設(shè)計(jì)基于抗原表位序列的新基因作為疫苗候選抗原,用于BCoV抗體的檢測和表位疫苗的研制。

本研究首次將BCoV S蛋白上兩段保守的能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原表位基因R1(351 aa～403 aa)和R2(771 aa～784 aa)經(jīng)柔性氨基酸(Gly4Ser)連接重復(fù)串聯(lián)表達(dá)2次,重組至pET-28a(+),構(gòu)建了pET28a-R原核重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá),并制備了其兔抗血清。為促進(jìn)BCoV表位疫苗的研究和基于抗原表位診斷試劑盒的開發(fā)進(jìn)行有意義的探索。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌種 pET-28a(+)原核表達(dá)載體由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心保存,大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3),購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 體重2～3 kg健康雄性新西蘭大白兔,購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種兔實(shí)驗(yàn)基地。

1.3 主要試劑 弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品;鼠抗6-組氨酸(His)單克隆抗體為武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG,均購自圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.4 方法

1.4.1 BCoV抗原表位的基因合成 根據(jù)目前GenBank數(shù)據(jù)庫中所公布的BCoV S基因序列,參照大腸桿菌密碼子偏嗜表,優(yōu)化BCoV流行株的抗原表位基因(351 aa～403 aa,771 aa～784 aa),表位間加入柔性氨基酸(Gly4Ser),重復(fù)串聯(lián)2次,在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基,送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4.2 重組表達(dá)載體pET-28a(+)-R的構(gòu)建與鑒定 用EcoR I和Not I雙酶切原核表達(dá)載體pET-28a(+)及基因合成質(zhì)粒,分別回收載體片段和目的基因片段,用T4DNA連接酶將目的基因片段連接到pET-28a(+)載體上,轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞,挑取雙酶切鑒定為陽性的單菌落,送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.4.3 融合蛋白R的純化 收集誘導(dǎo)表達(dá)pET-28a(+)-R的菌體沉淀,利用SDS-PAGE進(jìn)行融合蛋白表達(dá)形式的分析。參考QIAGEN蛋白純化手冊,以包涵體純化方法純化蛋白。SDS-PAGE電泳檢測,并測定蛋白的濃度。

1.4.4 融合蛋白R的Western-Blot鑒定 取純化的蛋白20 μL進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用5%TBST脫脂奶粉過夜封閉;TBST洗滌,加入一抗(鼠抗6-組氨酸(His)單克隆抗體,1∶5 000稀釋),室溫孵育結(jié)合2 h,TBST洗滌3次,每次5 min。再加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG,1∶4 000稀釋),室溫孵育2 h,TBST洗3次,每次5 min。各取1 ml ECL化學(xué)發(fā)光試劑A、B液混勻,1 min后覆蓋于PVDF膜的蛋白面,鑒定純化蛋白特異性。

1.4.5 多克隆抗體的制備 選取3月齡雄性新西蘭大白兔3只,1只免疫pET-28a(+)空載菌體蛋白,另外兩只免疫融合蛋白。每只新西蘭大白兔免疫重組抗原200 μg,免疫3次,間隔期為2周,均為背部皮下多點(diǎn)注射,首免用弗氏完全佐劑,二免、三免用弗氏不完全佐劑。每次免疫前采血留樣,三免14 d后耳靜脈采血測定效價,效價達(dá)到要求后心臟采血分離血清。

1.4.6 兔抗融合蛋白多克隆抗體檢測 參考1.4.5的操作步驟,取純化的蛋白20 μL跑電泳,融合蛋白免疫后的抗血清作為一抗(1∶1 000稀釋),HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG為二抗(1∶2 000稀釋),檢測純化蛋白的免疫原性及血清中的多克隆抗體。

1.4.7 R蛋白多克隆抗體的中和抗體效價測定R蛋白多克隆抗體56℃滅活30 min,2 000 r/min離心5 min,過濾,用不含有FBS的DMEM稀釋血清,從1∶2、1∶4、1∶8 ………1∶1 024 連續(xù)倍比稀釋,將牛冠狀病毒用不含有FBS的DMEM稀釋至200 TCID50/100 μL,然后將稀釋的血清與等體積的病毒液混合,于37℃作用1 h。接種已長成單層的HCT-8細(xì)胞,100 μL/孔,每個血清稀釋度作3個復(fù)孔,37℃培養(yǎng)2～3 d。同時設(shè)置陰陽對照。

2 結(jié)果

2.1 pET-28a(+)-R重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用質(zhì)粒提取試劑盒,提取pET-28a(+)-R重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切鑒定,在約513 bp(串聯(lián)基因R)和5 369 bp(pET-28a)各出現(xiàn)1條特異性條帶,與預(yù)期目的條帶大小基本一致(圖1)。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒測序后,經(jīng)BLAST比對正確。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-R的雙酶切鑒定

2.2 融合蛋白R的純化 變性條件下同時改變緩沖液pH值和咪唑濃度,利用雜蛋白、融合蛋白與Ni-NTA樹脂結(jié)合程度不同,將雜蛋白、融合蛋白分批洗脫下來,得到了比較純的融合蛋白(圖2)。

圖2 融合蛋白表達(dá)形式的鑒定及純化

2.3 融合蛋白R的Western-Blot鑒定 利用Histag抗體,對重組的pET-28a(+)-R蛋白進(jìn)行Western-Blot分析,pET-28a(+)-R蛋白能與His-tag抗體產(chǎn)生特異條帶(圖3)。

將免疫后新西蘭大白兔的抗血清作為一抗,對R蛋白進(jìn)行Western-Blot分析,發(fā)現(xiàn)R蛋白能與制備的兔抗血清產(chǎn)生特異條帶(圖3)。證明該融合蛋白具有免疫原性和免疫反應(yīng)性。

圖3 表達(dá)蛋白和抗血清的Western-Blot分析

2.4 R蛋白多克隆抗體的中和抗體效價測定 陽性孔(未添加血清)出現(xiàn)CPE時,而陰性血清(未添加病毒)及空白對照孔均未出現(xiàn)CPE時記錄每個血清稀釋度的CPE孔數(shù)。以能夠完全抑制CPE的血清最大稀釋度作為待檢血清的中和效價,R蛋白多克隆抗體的中和抗體效價為1∶8,能夠有效的中和牛冠狀病毒。

表1 中和試驗(yàn)CPE孔數(shù)

3 討論

S蛋白是BCoV結(jié)構(gòu)蛋白中最大的蛋白,全長1 363個氨基酸[6-7],基因組較大,不適合體外大量獲得融合蛋白。但是S蛋白是冠狀病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白,同時也是攜帶B淋巴細(xì)胞的主要抗原決定簇,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白[8],因此我們選擇將S蛋白的抗原表位基因串連重組表達(dá),第一,減少異體蛋白進(jìn)入機(jī)體引起的過度免疫反應(yīng),安全性好;第二,消除無關(guān)蛋白的干擾作用,增加對BCoV的特異性。另外,我們把選擇的抗原表位重復(fù)串聯(lián)兩次,可以克服單獨(dú)免疫時免疫性較弱和體內(nèi)易降解的弱點(diǎn),使表位具有更強(qiáng)的免疫原性,從而引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答,獲得長期的免疫力[9]。為成功制備多克隆抗體抗血清打下基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)根據(jù)IEDB數(shù)據(jù)庫收錄的牛冠狀病毒抗原表位序列和相關(guān)參考文獻(xiàn)[10],遴選出S蛋白上的2個抗原表位,利用柔性氨基酸將其串聯(lián),重組到pET-28a(+)載體上,誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,旨在獲得大量的高濃度高純度的融合蛋白。在傳統(tǒng)包涵體法純化蛋白的基礎(chǔ)上,借鑒可融性蛋白純化的方法,采用調(diào)節(jié)pH值大小、咪唑濃度梯度洗脫雜蛋白相結(jié)合的方法,得到了高純度的融合蛋白。

目前,臨床上治療BCoV感染的牛還沒有特效療法,主要是通過孕牛免疫和新生犢牛口服疫苗來提高免疫力[11],所以應(yīng)及時及早地應(yīng)用抗體或有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防和治療,而傳統(tǒng)疫苗的免疫效果還存在一些問題。因此研制BCoV的新型疫苗就顯得尤為重要。本研究將已經(jīng)驗(yàn)證的BCoV中和抗原表位基因串聯(lián)表達(dá),用表達(dá)的蛋白作為包被原,初步建立了檢測BCoV抗體水平的間接ELISA方法。同時用純化的蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得了含有BCoV抗體的高免血清。試驗(yàn)結(jié)果表明,抗原表位串聯(lián)融合表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。為BCoV診斷試劑盒的開發(fā)和促進(jìn)BCoV表位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。