宰 翔,于嘯洋,于孔森,李明皓,張國(guó)慶,王 佟,郝景鋒

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林 吉林 132101)

奶牛酮病發(fā)生過(guò)程中由于機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài),脂肪動(dòng)員加劇,在此過(guò)程中產(chǎn)生大量的非酯化脂肪酸(NEFA),而這些物質(zhì)的生成速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了肝臟通過(guò)氧化代謝排出的速度,以生成甘油三酯的形式在肝臟內(nèi)蓄積[1],會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生較大刺激,由于這種應(yīng)激性因素的作用,會(huì)對(duì)由肝臟合成的急性期反應(yīng)蛋白HP和SAA產(chǎn)生較大影響,但具體會(huì)產(chǎn)生哪些變化目前還不清楚,NEFA以及BHBA作為機(jī)體中間代謝產(chǎn)物,在酮病發(fā)生時(shí),它們的濃度會(huì)發(fā)生顯著的變化,肝臟作為脂類(lèi)物質(zhì)的主要代謝器官,起著重要的作用,而NEFA和BHBA可能是脂類(lèi)代謝關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素。眾多的研究者采用了熒光定量PCR法檢測(cè)了在長(zhǎng)途運(yùn)輸以及炎癥產(chǎn)物的刺激下對(duì)各種動(dòng)物的急性期反應(yīng)蛋白的表達(dá)的影響,取得了令人滿(mǎn)意的效果。

本研究采用的是利用貼壁法[2]培養(yǎng)新生犢牛原代肝細(xì)胞,于培養(yǎng)72 h通過(guò)添加(0、0.6、1.2、2.4 mmol/L)NEFA 以及(0、0.6、1.2、2.4 mmol/L)BHBA,培養(yǎng)24 h后收樣,無(wú)菌提取肝細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)熒光定量PCR法測(cè)定NEFA、BHBA對(duì)體外培養(yǎng)牛肝細(xì)胞的HP和SAA mRNA表達(dá)的影響,通過(guò)體外試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NEFA、BHBA等代謝產(chǎn)物對(duì)急性期反應(yīng)蛋白HP、SAA表達(dá)的影響,為進(jìn)一步揭示奶牛酮病發(fā)病機(jī)理、奶牛酮病時(shí)機(jī)體免疫狀態(tài)以及合理有效治療與預(yù)防奶牛酮病奠定一定的理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 載體及宿主菌pMD-18T Vector,購(gòu)自TaKaRa公司;E.coli DH5α宿主菌為吉林大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝與中毒病實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 試劑 肝細(xì)胞6孔培養(yǎng)板,購(gòu)自Gibco公司;低糖DMED培養(yǎng)基,HEPES,新生牛血清,以及Ⅳ型膠原酶等,均購(gòu)自Gibco公司;TRIZol RNA提取試劑盒,購(gòu)自Invitrogen公司;Tris和X-gal為Promega產(chǎn)品;焦磷酸二乙酯(DEPC),購(gòu)自Sigma公司;多聚賴(lài)氨酸、胰島素均系Sigma公司產(chǎn)品;標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA Marker DL-2 000(分子量為100～2 000 bp)、DNA凝膠回收試劑盒、dNTPs(2.5 mmol/L each)、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、ExTaq DNA聚合酶、Oligo dT、RNase Inhibitor、限制性?xún)?nèi)切酶,購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 肝細(xì)胞分離與培養(yǎng)采用貼壁法[2]。

1.4 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)分為8組包括BHBA(0、0.6、1.2、2.4 mmol/L)[5]和 NEFA(0、0.6、1.2、2.4 mmol/L)組。

1.5 引物的設(shè)計(jì)和合成 從GenBank中查閱出奶牛的HP、SAA基因序列,利用Primer Express 5.0設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),由長(zhǎng)春華大中天生物技術(shù)有限公司合成。目的基因引物的設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 PCR引物

1.6 肝臟組織中RNA提取 小牛肝臟組織50～100 mg,加入適量液氮研磨,收集至1.5 mL離心管中,分別加入TRIZol和氯仿,取上清液加入等量的異丙醇,加入75%乙醇沉淀后DEPC處理[3],樣品放入-80℃保存。

1.7 樣品RNA反轉(zhuǎn)錄 具體方法根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(TaKaRa)。

1.8 PCR擴(kuò)增基因以上反應(yīng)得cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,體系見(jiàn)表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表3。

表3 PCR反應(yīng)條件

1.9 PCR產(chǎn)物回收 PCR產(chǎn)物回收選用的是AxyPrep DNA膠回收試劑盒,按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.10 目的基因克隆 首先將目的基因與載體連接。構(gòu)建成重組克隆質(zhì)粒 pMD-SAA、pMD-HP、pMD-β-actin連接反應(yīng)體系見(jiàn)表4。

表4 連接反應(yīng)體系

1.11 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 取上述4管感受態(tài)細(xì)胞,分別加入5 μL 連接產(chǎn)物(空載體、pMD-HP、pMD-SAA和pMD-β-actin),靜止30 min后42℃水浴加熱1 min[4],放置冰上(4℃)后加入LB液體培養(yǎng)基置于37℃搖床中培養(yǎng)。

1.12 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 PCR鑒定以上提取的質(zhì)粒,對(duì)照選取陰性質(zhì)粒。反應(yīng)物用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行鑒定。

1.13 SAA、HP、β-actin基因序列測(cè)定 將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)確定引物是否設(shè)計(jì)符合要求。

1.14 樣品中HP、SAA mRNA水平的定量檢測(cè)HP、SAA以及β-actin基因的熒光定量PCR反應(yīng)條件體系見(jiàn)表5,反應(yīng)條件見(jiàn)表6。

表5 RT-qPCR反應(yīng)體系

表6 RT-qPCR反應(yīng)條件

1.15 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用X-±SD表示,用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析,組間差異顯著性用ANOVA(方差分析)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞總RNA的提取 如圖1所示,自肝細(xì)胞中提取的總RNA通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,出現(xiàn)完整的3條帶,分別是5 S、18 S以及28 S,條帶清晰可見(jiàn),沒(méi)有出現(xiàn)明顯的降解,符合反轉(zhuǎn)錄的基本要求,并且A260/A280值均為1.9,符合試驗(yàn)對(duì)于純度的需求,可以滿(mǎn)足熒光定量PCR的要求。

圖1 肝細(xì)胞總RNA電泳圖譜圖

2.2 目的基因的PCR結(jié)果 通過(guò)PCR對(duì)目的基因進(jìn)行確定,結(jié)果如圖2、3、4所示。β-actin PCR擴(kuò)增結(jié)果在101 bp,HP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果在165 bp,SAA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果在127 bp。

圖2 內(nèi)參β-actin PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 HP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 SAA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 犢牛肝細(xì)胞不同時(shí)間的形態(tài)學(xué) 見(jiàn)中插彩版圖5～8。

2.4 不同濃度梯度的NEFA對(duì)體外培養(yǎng)牛肝細(xì)胞中HP、SAA mRNA表達(dá)影響 由圖9、圖10以及表7統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)：在刺激因子NEFA作用下,HP基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)明顯增高,其中中等濃度處理組與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01),中高濃度處理組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05),高濃度處理組與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明,中等濃度NEFA能促進(jìn)肝細(xì)胞中HP的表達(dá);在刺激因子NEFA作用下,中等濃度處理組可以促進(jìn)進(jìn)肝細(xì)胞中SAA基因的表達(dá),其中0.6 mmol/L處理組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05),而1.2 mmol/L處理組與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01),說(shuō)明中等程度的NEFA能促進(jìn)犢牛肝細(xì)胞中SAA表達(dá),高濃度刺激物對(duì)肝細(xì)胞中SAA的表達(dá)無(wú)明顯的影響。

表7 NEFA對(duì)體外培養(yǎng)原代肝細(xì)胞HP、SAA mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

圖9 NEFA對(duì)體外培養(yǎng)原代肝細(xì)胞HP mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

圖10 NEFA對(duì)體外培養(yǎng)原代肝細(xì)胞SAA mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.5 不同濃度梯度的BHBA對(duì)體外培養(yǎng)牛肝細(xì)胞中HP、SAA mRNA表達(dá)影響 由以圖11、圖12以及表8所示：在刺激因子BHBA作用下,HP基因表達(dá)出現(xiàn)了一定程度的減少,其中中等濃度處理組表現(xiàn)出抑制作用,且中等程度處理組與對(duì)照組均表現(xiàn)差異顯著(P＜0.05),而2.4 mmol/L的BHBA處理組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05),說(shuō)明中等濃度的BHBA對(duì)HP基因的表達(dá)具有抑制作用,高濃度的BHBA對(duì)HP基因的表達(dá)影響較小;BHBA作為刺激因子對(duì)SAA基因的表達(dá)影響較小,只是在0.6 mmol/L的BHBA處理組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05),但總體趨勢(shì)為抑制作用。

圖11 BHBA對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞HP mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影

圖12 BHBA對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞SAA mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

表8 BHBA對(duì)體外培養(yǎng)原代肝細(xì)胞HP、SAA mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論與分析

NEFA是調(diào)控機(jī)體脂肪、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等物質(zhì)代謝過(guò)程的重要影響因素,也是奶牛能量負(fù)平衡(NEB)的主要標(biāo)志[5],生理狀態(tài)下,奶牛在生產(chǎn)時(shí)NEFA濃度一般可以達(dá)到1 mmol/L[6],酮病發(fā)生時(shí),由于NEB引起脂肪動(dòng)員,NEFA水平升高,過(guò)多的NEFA在肝臟內(nèi)代謝對(duì)機(jī)體較大的刺激,但對(duì)于急性期蛋白HP、SAA在肝臟中表達(dá)是否會(huì)產(chǎn)生影響未見(jiàn)報(bào)道。

HP、SAA是奶牛在炎癥、應(yīng)激以及感染過(guò)程中產(chǎn)生的急性期反應(yīng)蛋白,HP主要由肝臟合成,后期研究發(fā)現(xiàn),在腦、脾、食道、腸、腎等器官中也有所表達(dá)[7],而且不同部位表達(dá)量有所不同,在炎癥刺激下,HP mRNA表達(dá)量在大鼠肺、肝、腎以及脾內(nèi)均有不同程度增加,然而在相同炎癥刺激下,HP mRNA表達(dá)量在大鼠睪丸內(nèi)卻下降了4倍[8],研究發(fā)現(xiàn),HP在奶牛乳房炎發(fā)生時(shí)表達(dá)增加明顯,可以作為奶牛乳房炎的判定指標(biāo)和預(yù)后判斷依據(jù)[9];SAA既可以在脂肪組織中合成,也可以在肝臟中合成,在肝臟中合成更具優(yōu)勢(shì)[10],對(duì)于SAA這種急性期反應(yīng)蛋白目前研究較多的是關(guān)于它對(duì)奶牛乳房炎的研究以及其對(duì)肥胖以及糖尿病的研究。

在本次試驗(yàn)中,經(jīng)刺激因子NEFA在0.6 mmol/L以及1.2 mmol/L時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)犢牛肝細(xì)胞HP基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用,其中中低濃度處理組與對(duì)照組差異極顯著,促進(jìn)作用更為明顯,而高濃度處理組對(duì)HP基因幾乎不產(chǎn)生影響,可能是高濃度對(duì)HP具有一定的抑制作用,需進(jìn)一步驗(yàn)證;對(duì)于SAA基因的作用與HP基因的作用相當(dāng),中等程度對(duì)SAA基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用,其中中低濃度0.6 mmol/L處理組促進(jìn)作用更為突出,說(shuō)明在NEFA添加物的作用下,急性期反應(yīng)蛋白HP、SAA的表達(dá)具有上升趨勢(shì)。