林芳明,張紅見,朱艷偉,趙 靜

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810016)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)是引起食物中毒的主要病原菌,也會導(dǎo)致臨床感染肺炎及傷口感染。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素(Stphylococcal enterotoxin,SE),按其血清型可分為 A、B、C、D、E 五種主要的基因型,引起從輕微疾病到感染性休克等不同程度的疾病[1-2]。中國在全世界因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第四位[3]。在美國,每年由金黃色葡萄球菌引起食源性疾病發(fā)生的病例達(dá)24萬例,是發(fā)生率較高的5種病原菌之一[4]。金黃色葡萄球菌食物中毒事件的不斷增加,在全世界引起了廣泛的關(guān)注[5]。

近幾年,國內(nèi)關(guān)于食品中金黃色葡萄球菌的污染狀況及其腸毒素基因型的分布研究報道較少,尤其是西寧市食品中金黃色葡萄球菌污染狀況和腸毒素基因型的分布狀況尚不清楚,為了了解西寧市金黃色葡萄球菌的污染情況以及腸毒素基因在食品中的分布特性,為食品質(zhì)量安全控制提供指導(dǎo),筆者于2017年8月-2018年3月對其進行了研究,報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 按照食品微生物檢驗采樣的要求,于2017年8月-2018年3月分別從西寧市的集貿(mào)市場、大型超市、路邊攤點進行樣品采集,生鮮牛乳、包裝牛乳、蔬菜(茄子、青菜和西蘭花)、豬肉和牛肉,共計108份。

1.1.2 質(zhì)控菌株ATCC 25923 由青海省食品藥品檢驗所提供。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 電子分析天平、超純水儀、全自動立式高壓滅菌鍋、TDZ5-WS多管架自動平衡離心機、LX-100手掌型離心機、SHZ-82回旋式氣浴恒溫振蕩器、水平電泳槽、VORTEX-GENTEZ渦旋振蕩器、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-PRO 200E)、PCR儀(Bio-Rad)、Autoflex Speed基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀(德國布魯克公司)、MK-20干式恒溫器(ALLSHNEG杭州奧盛儀器有限公司)。

1.1.4 主要試劑及培養(yǎng)基 DNA Marker DL-2 000、2xEs Taq Master Mix、PCR回收試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品);pMD-18T、Bacteria DNA Kit提取試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品);凍干兔血漿、7.5%NaCl肉湯、亞碲磺酸增菌液、Baird-Parker培養(yǎng)基、LB肉湯、營養(yǎng)瓊脂基礎(chǔ)、血瓊脂平板(康為世紀(jì)公司產(chǎn)品)。

1.1.5 兔血漿健康兔心臟采血分離血漿。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的分離 (1)樣品處理：樣品中加入滅菌生理鹽水,混勻,備用;(2)增菌及分離培養(yǎng)：無菌操作取處理過的樣品,接至7.5%NaCl肉湯,37℃培養(yǎng)24 h,再轉(zhuǎn)接至Baird-Parker平板,37℃培養(yǎng)24 h,至無雜菌。挑取疑似菌落,斜面保存。

1.2.2 金黃色葡萄球菌的鑒定 (1)革蘭染色;(2)溶血試驗;(3)血漿凝固酶試驗;(4)生化試驗。以上鑒定均參照文獻[6]試驗方法進行。

1.2.3 MALDI-TOF MS鑒定

1.2.3.1 樣品制備 采用擴展直接涂抹法流程檢測,用無菌槍頭挑取新鮮純菌落,并涂到拋光靶板圓孔上,自然晾干,加1 μL 70%甲酸水溶液,破壁釋放蛋白質(zhì)。之后均勻地加入1 L基質(zhì)溶液,晾干備用。按照上述操作,向靶上滴加校正標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3.2 質(zhì)譜圖的采集和分析 用標(biāo)準(zhǔn)品對儀器校準(zhǔn)后,應(yīng)用MALDI Biotyper軟件采集并分析樣品圖譜信息,以Bruker結(jié)果作為判定標(biāo)準(zhǔn),分值與準(zhǔn)確度成正比,2.3-3.0分值表示非?？尚诺罔b定到菌種水平;1.700 0以下表示鑒定結(jié)果不可靠。

1.2.4 金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶(nuc)基因及腸毒素SE基因的PCR鑒定

1.2.4.1 引物的合成：根據(jù)GenBank發(fā)布的耐熱核酸酶(nuc)基因序列及5種腸毒素A、B、C、D和E基因序列,利用DNAStar軟件設(shè)計引物(表1),由西安擎科西生物科技有限公司合成。

表1 金黃色葡萄球菌nuc及SE基因引物序列

1.2.4.2 DNA模板提?。焊鶕?jù)寶生物細(xì)菌基因組提取試劑盒提取金黃色葡萄球菌基因組。

1.2.4.3 PCR 反 應(yīng) 體 系(25 μL)：2 × Taq Mix 12.5 μL,引物 F 和 R 各(10 μmol/L)1 μL,DNA 模板1 μL,ddH2O 9.5 μL。 反應(yīng)程序(nuc、SEA、SEB 和SED)：94℃,5 min(預(yù)變性);94℃,40 s,50℃,45 s,72℃,1 min;72℃,10 min;16℃保存(35 Cycle)。

電泳鑒定：將PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測耐熱核酸酶(nuc)基因和腸毒素SE基因。電泳完成后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.5 金黃色葡萄球菌nuc和SEA、SEB、SED克隆與測序 目的DNA片段回收,連接和轉(zhuǎn)化參照文獻[7]試驗方法操作。根據(jù)藍(lán)白斑篩選原則篩選陽性克隆。送往西安擎科生物科技有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI上進行Blast比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的分離及生化鑒定 108份食品樣品分離出疑似金黃色葡萄球菌60株,疑似菌株在Baird-Parker平板上呈透明圈明顯的灰色到黑色菌落(圖1A);鏡下呈葡萄串狀排列的革蘭陽性菌(圖1B);血平板上呈圓形、光滑、濕潤的菌落(圖1C)。血漿凝固酶試驗呈傾斜離心管不流動的凝固狀態(tài)(圖1D);糖類發(fā)酵試驗菌液變黃;甲基紅試驗菌液上層呈紅色;接觸酶陽性試驗有氣泡產(chǎn)生(表2)。

圖1 金黃色葡萄球菌的鑒定結(jié)果

2.2 金黃色葡萄球菌質(zhì)譜分析結(jié)果 通過飛行時間質(zhì)譜鑒定顯示(圖2),在60株金黃色葡萄球,除4株金黃色葡萄球菌外,其余56株菌的檢出分值均在2.445～2.451之間,表示準(zhǔn)確地鑒定到菌種水平。其中質(zhì)控菌株ATCC 25923的主要特征性質(zhì)譜峰值為6 892.1。

2.3 金黃色葡萄球菌及其腸毒素基因型的PCR鑒定結(jié)果 PCR擴增金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶(nuc)基因,測序、序列比對,目的條帶為279 bp(圖3),BLAST驗證結(jié)果表明,相似度在99%以上。同時,通過PCR對60株金黃色葡萄球菌的五種腸毒素基因型(A、B、C、D、E)進行分型檢測,結(jié)果擴增出A、B和D三種腸毒素基因型的目的片段(圖3),分別為 265 bp、205 bp、509 bp,未檢測到 C型和E型,也未檢測到同時攜帶兩種腸毒素基因型的菌株。

表2 金黃色葡萄球菌的生化鑒定結(jié)果

圖2 金黃色葡萄球菌質(zhì)譜分析結(jié)果

2.4 不同種類及來源食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素基因型的分布情況 本研究樣品共108份,經(jīng)分離鑒定,其中60份檢出金黃色葡萄球菌,檢出率為55.56%,豬肉檢出率最高,為75%。見表3。

圖3 金黃色葡萄球菌nuc及SE基因的PCR結(jié)果

表3 樣品中金黃色葡萄菌及其腸毒素的分布

同時發(fā)現(xiàn),生鮮牛乳和包裝牛乳的的檢出率為57.14%、14.28%,這表明適當(dāng)?shù)陌b可以減少金黃色葡萄球菌的污染。肉制品的檢出率為牛肉62.5%、豬肉75%,其中牛肉來自大型超市,豬肉來自農(nóng)貿(mào)市場,需引起高度重視。蔬菜(茄子、青菜、西蘭花)的檢出率為62.5%,這可能與環(huán)境條件有關(guān),易受人手和灰塵的污染。

3 討論

3.1 試驗方法對比分析 近幾年,MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)展迅速,該技術(shù)通過細(xì)菌蛋白特征圖譜鑒定不同微生物。尤其是臨床病原微生物的鑒定,國內(nèi)外都已廣泛應(yīng)用[8-9],與傳統(tǒng)微生物方法相比,MALDI-TOF-MS準(zhǔn)確性較高,實現(xiàn)了對目標(biāo)菌株的檢出。相對于PCR技術(shù),是一種快速、簡便、高通量檢測食品中金黃色葡萄球菌和腸毒素基因的方法,同時也通過PCR方法對檢出結(jié)果進行驗證,顯示了兩種方法良好的一致性。

3.2 不同來源食品中金黃色葡萄球菌的污染情況 本次研究所采集的幾類不同樣品均分離檢測到金黃色葡萄球菌,且陽性率較高,是引起西寧市部分地區(qū)食品安全的主要病原菌,說明食品中金黃色葡萄球菌污染較嚴(yán)重。除了來自大型超市的包裝牛乳,其余所采樣品中金黃色葡萄球菌陽性菌株都很多。金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎最主要的致病菌,嚴(yán)重影響生鮮乳質(zhì)量[10]。同時作為主要的食源性致病菌[11],該菌以乳和乳制品為主的食物中毒事件日益增多[12]。樣品中的生鮮牛乳主要來源于路邊攤,其污染源大多是擠奶之后導(dǎo)致的二次污染,即使滅過菌,牛乳成分中的營養(yǎng)全面,適合金黃色葡萄球菌的生長,加上奶制品本身及其容易受污染,所以很容易在乳中存活。來自農(nóng)貿(mào)市場蔬菜的檢出率也很高,和牛肉的檢出率62.5%不相上下,這可能是在運輸過程中和環(huán)境條件的污染有關(guān)。此外,生鮮肉適合金黃色葡萄球菌的生長,也易污染金黃色葡萄球菌。

金黃色葡萄球菌在人居住環(huán)境中有很好的適應(yīng)性,國內(nèi)的報道中金黃色葡萄球菌的人體帶菌率也較高[13]。本次調(diào)查結(jié)果提示,西寧市食品市場均受到了一定程度污染,肉制品及生鮮牛乳污染尤為嚴(yán)重。所以應(yīng)該加強各類食品的加工、儲藏、運輸、銷售過程的衛(wèi)生監(jiān)管力度,減少食源性疾病導(dǎo)致食物中毒的發(fā)生率。同時,適當(dāng)?shù)陌b加工可避免交叉污染,食品包裝可調(diào)節(jié)食品所處的環(huán)境進而更好的保存食品[14]。政府部門應(yīng)通過大量采集樣品加強金黃色葡萄球菌的污染監(jiān)測,做好食品安全的監(jiān)督工作,控制食源性疾病的發(fā)生。

3.3 不同來源食品中腸毒素基因型的分布情況經(jīng)對5種腸毒素基因型進行鑒定,其中腸毒素B型的檢出率最高,為56.67%。然而D型腸毒素的檢出率很低,這可能與食品來源和種類有關(guān)。其中,肉類中腸毒素B型檢出率和蔬菜的檢出率一樣,為26.67%。從結(jié)果看,直接來源于動物體(如豬牛羊)腸毒素B型的檢出率和在一些植物性食品(如果蔬)的檢出率一樣高。所以,蔬菜的監(jiān)測也不容忽視。關(guān)于腸毒素E型檢出率的報道,大都是未檢出或檢出率較低[15]。本研究E型腸毒素未檢出。研究表明,在食品的不同樣品中分離得到的金黃色葡萄球菌菌株,很多菌株都具有腸毒素活性：德國研究發(fā)現(xiàn),從牛奶中分離的70%金黃色葡萄球菌具有腸毒素基因[16]。傅丹青對食品、公共場所檢測樣品及食物中毒樣品分離的金黃色葡萄球菌菌株進行腸毒素檢測,發(fā)現(xiàn)腸毒素基因的攜帶率為47.83%[17]。研究表明,攜帶腸毒素B型基因的菌株與食物中毒有關(guān)[18]。腸毒素B型的檢出率最高,表明腸毒素B型與其他4種腸毒素進入細(xì)胞的方式不同。對于蔬菜,肉制品中腸毒素的檢出率高于蔬菜,農(nóng)貿(mào)市場和路邊攤的檢出率高于大型超市。因此,食品樣品來源和種類不同,其腸毒素基因分布不同,毒素基因型也不同。

4 結(jié)論

對西寧市不同來源、不同種類108份食品樣品進行金黃色葡萄球菌進行分離鑒定,共分離出60株,檢出率為55.56%;其中,腸毒素基因型檢測出42株,檢出率為70%。食品的來源和種類不同,污染情況也各異,腸毒素基因型的分布情況也各異。金黃色葡萄球菌污染主要是原料帶菌與加工或運輸貯存過程的污染;攜帶不同腸毒素基因型的菌株與其來源有密切關(guān)系。