李開國(guó) 王茹月 楊曉慧 曲頌

乳腺癌是起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)居女性癌癥發(fā)病率的首位，是女性癌癥死亡的主要原因［1］。2017年腫瘤登記中心數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌位居我國(guó)女性癌癥發(fā)病率首位，惡性腫瘤死因第5位［2］。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Pygopus2（PYGO2）是經(jīng)典 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的重要組成部分，在正常組織和惡性組織中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化［3-4］。既往研究表明，在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，人PYGO2啟動(dòng)子通過ETS（E-twentysix）家族成員ELF-1（E74-like factor 1）激活原癌基因的表達(dá)［5］。有學(xué)者通過shRNA（small hairpin RNA）抑制PYGO2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞的增殖數(shù)量減少，侵襲能力降低［6］。據(jù)此推測(cè)PYGO2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。盡管PYGO2表達(dá)異常在前列腺癌［7］、肝癌［8］、食管鱗狀細(xì)胞癌［9］、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤［10］等多種腫瘤中已有報(bào)道，但在乳腺癌中卻鮮有研究，且由于研究方法、樣本量和人群的差異，其結(jié)論可靠性較低。

Oncomine是全球最大的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，目前已經(jīng)收錄了715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集、86 733個(gè)癌癥組織和正常組織的樣本數(shù)據(jù)，該平臺(tái)整合的文獻(xiàn)及芯片數(shù)據(jù)因高質(zhì)量而得到科研人員的高度認(rèn)可。而Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫是目前分析預(yù)后應(yīng)用較廣泛的在線數(shù)據(jù)庫，涵蓋了5 143例乳腺癌樣本，可對(duì)54 675個(gè)基因進(jìn)行相關(guān)預(yù)后分析，并得出較客觀的結(jié)果。本研究采用Oncomine數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析PYGO2在乳腺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步研究乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供線索。

1 資料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

在 Oncomine數(shù)據(jù)庫（https：//www.oncomine.org/resource/login.html）中根據(jù)本研究的需求設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)條件：⑴“Cancer Type：Breast cancer”；⑵“Gene：PYGO2”；⑶“Data Type：All”；⑷“Analysis Type：CancervsNormal Analysis”；⑸臨界值設(shè)定條件（P value＜0.05，fold change＞2，gene rank=All）。

1.2 Kaplan-Meier Plotter進(jìn)行生存分析

利用 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）中的 Breast cancer（mRNA）數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析。篩選條件：⑴“Cancer：Breast Cancer”；⑵“Gene symbol：PYGO2”；⑶“Split patients by：Auto select best cutoff”；⑷“Survival：OS/RFS/DMFS”；⑸“Follow up threshold：All”。本研究預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)包括總生存期（overall survival，OS）、無復(fù)發(fā)生存期（relapse-freesurvival，RFS）和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期（distant metastasis-free survival，DMFS）。OS定義為癌癥診斷之日起至因任何原因引起死亡的時(shí)間。RFS定義為從癌癥初次治療至最早出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或死亡的時(shí)間。DMFS定義為從癌癥初次治療至最早出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或死亡的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫和SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述PYGO2基因的表達(dá)量，其在正常組織與乳腺癌組織的差異分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析PYGO2表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系，組間比較用Log-rank檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PYGO2在常見腫瘤類型中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集了307項(xiàng)關(guān)于PYGO2在不同類型腫瘤組織與正常組織比較的研究結(jié)果，其中208項(xiàng)研究PYGO2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PYGO2表達(dá)增高的研究164項(xiàng)、表達(dá)降低的研究44項(xiàng)，在乳腺癌中高表達(dá)的研究32項(xiàng)，低表達(dá)的研究0項(xiàng)，見圖1。

2.2 PYGO2在乳腺癌組織中的表達(dá)

2004年至今，Oncomine數(shù)據(jù)庫共有45項(xiàng)研究涉及PYGO2在乳腺癌組織和正常組織中的差異表達(dá)分析，共有3730個(gè)樣本，見圖2。研究成果分別發(fā)表于MolBiol Cell［11］、Proc Natl Acad Sci USA［12］、Nature［13-14］、Breast Cancer Res［15］、BMC Cancer［16］、Cancer Cell［17］、Breast Cancer Res Treat［18］和Nat Med［19］等雜志。在Oncomine數(shù)據(jù)庫中薈萃分析45項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，PYGO2基因在所有差異表達(dá)基因中其中位數(shù)值排名為1 214，并在乳腺癌組織中呈高表達(dá)（P=7.32×10－9）。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中所有腫瘤相關(guān)研究PYGO2的表達(dá)

2.3 PYGO2在不同乳腺癌研究芯片數(shù)據(jù)集中腫瘤組織和正常組織之間的表達(dá)差異

Oncomine數(shù)據(jù)庫中PYGO2在不同乳腺癌研究芯片數(shù)據(jù)集中的表達(dá)結(jié)果顯示，PYGO2在乳腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常組織（P＜0.05，F(xiàn)old change＞2），見圖 3、表 1。

2.4 PYGO2表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫［20］分析PYGO2表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示PYGO2高表達(dá)組乳腺癌患者 OS（HR=0.69，95%CI：0.51～0.95，P=0.021）、RFS（HR=0.60，95%CI：0.51～0.70，P＜0.001）以及 DMFS（HR=0.61，95%CI：0.43～0.87，P=0.005）均優(yōu)于低表達(dá)組，見圖4。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中乳腺癌PYGO2基因的表達(dá)

圖3 Oncomine數(shù)據(jù)庫中不同乳腺癌研究芯片數(shù)據(jù)集PYGO2的表達(dá)

表1 PYGO2基因在不同乳腺癌研究芯片數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況

圖4 PYGO2基因表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)［21］顯示，2004～2013年女性乳腺癌發(fā)病率呈緩慢上升趨勢(shì)，從1989年到2015年，美國(guó)乳腺癌死亡率約下降了39%。有研究報(bào)道這可能得益于人類表皮生長(zhǎng)因子受體2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子受體等治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及靶向藥物在乳腺癌治療中的應(yīng)用［22］。然而這些靶點(diǎn)僅存在于部分乳腺癌患者，因此尋找乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子或靶點(diǎn)，對(duì)開發(fā)新的治療乳腺癌的靶向藥物具有重要意義。

PYGO2基因定位于1q21.3，是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要組成部分，可能編碼染色質(zhì)重塑蛋白，通過組蛋白甲基化發(fā)揮組蛋白密碼子的翻譯作用，促進(jìn)機(jī)體正常發(fā)育［23］和激活腫瘤發(fā)生［24］的關(guān)鍵基因。PYGO2基因在多種腫瘤中的研究越來越多，但在乳腺癌中的研究相對(duì)較少。盡管有研究發(fā)現(xiàn)PYGO2基因在乳腺癌中高表達(dá)［11］，但由于樣本量小，可信度較差。Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前全球最大的基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析共發(fā)現(xiàn)45項(xiàng)研究（包括3 730個(gè)樣本）涉及乳腺癌組織和正常組織中PYGO2表達(dá)的比較（高表達(dá)研究32項(xiàng)，低表達(dá)研究0項(xiàng)），其中3項(xiàng)研究結(jié)果顯示PYGO2在乳腺癌組織中的表達(dá)量高于正常組織，再次驗(yàn)證了PYGO2基因在乳腺癌組織中呈高表達(dá)這一結(jié)論。進(jìn)一步通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PYGO2表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)，即PYGO2高表達(dá)患者的OS、RFS以及DMFS均優(yōu)于低表達(dá)者，分析原因可能為PYGO2基因是一種乳腺癌保護(hù)基因，當(dāng)機(jī)體發(fā)生乳腺癌病變后其表達(dá)量升高，從而抑制腫瘤增殖、遷移或侵襲等，有利于患者的預(yù)后［25］，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，PYGO2基因在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與乳腺癌患者預(yù)后密切相關(guān)，有望成為協(xié)助診斷乳腺癌和評(píng)估患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究采用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行大樣本分析，避免樣本量過小產(chǎn)生的誤差，分析結(jié)果具有更高的可信度，但是這些數(shù)據(jù)均來自芯片檢測(cè)結(jié)果，相關(guān)結(jié)論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。