羅 濤，彭細娟，楊彥龍

空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710038 1神經外科；2重癥醫(yī)學科

神經膠質瘤亦被稱作膠質細胞瘤，簡稱為膠質瘤，主要發(fā)生于神經外胚層，是一種常見的惡性腫瘤，占所有顱內腫瘤的35.26% ～ 60.96%[1]。膠質瘤的常見分類有星形細胞瘤、星形母細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、少枝膠質細胞瘤等[2]。因其多呈浸潤性生長，并與正常腦組織無明顯分界，故具有“三高一低”的特點，即發(fā)病率高、死亡率高、復發(fā)率高及治愈率低[3]。到目前為止，針對膠質瘤的治療仍以手術為主(顯微外科手術、神經導航手術、術中熒光實時導航下膠質瘤切除術)，并輔以放療和化療[4]。然而腫瘤細胞對放療的輻射耐受程度可能引起殘余病灶再次復發(fā)，這使其至今仍是治療困難、預后最差的一類中樞系統(tǒng)腫瘤[5-6]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的無編碼功能的RNA分子。最初有研究者認為其是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，不具備生物學功能[7]。但目前多項研究發(fā)現lncRNA可以在表觀遺傳水平、轉錄和轉錄后水平調控基因表達，參與調控細胞的不同生物學進程，包括細胞周期、基因穩(wěn)定性及染色質結構等，而且在一系列不同類型的細胞和疾病中發(fā)揮著重要的作用。這表明長鏈非編碼RNA對細胞功能的調控幾乎無處不在[8-9]。核仁小分子RNA宿主基因(SNHG)是對惡性腫瘤具有重要生物學調控作用的一類長鏈非編碼RNA[10-11]。其中的SNHG3，也稱為U17的宿主基因(U17HG)，位于1號染色體短臂3區(qū)6號帶。先前有相關研究表明，lncRNA SNHG3的表達可能在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用[12-13]。然而，目前有關SNHG3在神經膠質瘤中作用的研究極少，其在膠質瘤中表達的臨床意義尚不清楚。本實驗采用實時熒光定量技術，通過檢測SNHG3在70例不同級別膠質瘤組織和30例正常腦組織中的表達水平差異，分析SNHG3在膠質瘤組織中的表達與膠質瘤臨床病理因素之間的相關性，并分析SNHG3對膠質瘤患者的預后價值。

資料和方法

1 資料 采集空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院神經外科自2008年6月- 2013年6月收治的70例腦膠質瘤患者臨床資料和腫瘤組織樣本，同時采集同期入院進行顱腦外科手術的30例病例正常腦組織進行對照。所有樣本的獲取符合空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會的協議，參與到本研究的患者均已簽署知情同意書。入選患者經手術病理學確診，組織病理采集前患者均未進行放、化療治療或其他抗癌治療。入選患者年齡在25 ～ 75歲，平均年齡為50歲，年齡＜50歲30例，≥50歲40例；其中男性32例，女性38例；KPS評分≥80分27例，＜80分43例；腫瘤直徑＜4 cm 26例，≥4 cm 44例；單發(fā)腫瘤33例，多發(fā)腫瘤37例；術后復發(fā)34例，未復發(fā)36例。按照WHO(2007年)神經系統(tǒng)腫瘤分類的標準分級：Ⅰ級～Ⅱ級29例，Ⅲ級～Ⅳ級41例。

2 提取RNA以及SNHG3檢測 將證實有腫瘤細胞存在的膠質瘤組織標本和正常腦組織標本進行脫蠟處理，采用Trizol法(Invitrogen，CA，USA)提取組織標本中的總RNA。用紫外分光光度計測定組織標本在波長為260 nm以及280 nm處的吸光度比值，計算RNA濃度并評估純度，選取OD值在1.9 ～ 2.0的RNA樣品。根據逆轉錄試劑盒說明將RNA樣品逆轉錄為cDNA。然后應用RT-PCR法分別檢測神經膠質瘤組織和正常腦組織標本中SNHG3的表達水平，內參基因設置為GAPDH。SNHG3擴增條件：95℃預變性30 s，隨后95℃、5 s，60℃、34 s，共40個循環(huán)。引物及探針序列，SNHG3上游引物正向：5'-CAGTGGTCGCTTCTTCT CCTT-3'，下游引物反向：5'-GGCATGAAATGCAC CTCAAT-3'，GAPDH上游引物正向：5'-TGTTGCC ATCAATGACCCCTT-3'，下游引物反向：5'-CTCCA CGACGTACTCAGCG-3'。所有qRT-PCR的引物特異性和效率性均經過檢驗。使用2-ΔΔCt相對定量方法計算倍數變化，所有實驗至少重復3次。

3 隨訪 術后對患者進行3個月1次的定期隨訪，短期隨訪主要以門診復診形式進行，遠期隨訪主要以電話隨訪形式進行。隨訪截止時間為2018年6月。隨訪內容為一般資料、KPS評分以及術后是否復發(fā)。

4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS22.0(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以-x±s表示，組間比較應用t檢驗；參數資料分析采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較用log-rank檢驗，應用單因素和多因素Cox比例風險回歸模型評估膠質瘤患者不同臨床病理特征與臨床預后之間的相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 神經膠質瘤組織中SNHG3表達水平高于正常腦組織 RT-PCR的檢測結果發(fā)現，SNHG3在神經膠質瘤組織中表達水平與正常腦組織相比明顯上調 (2.764±0.280 vs 1.000±0.297，P=0.001)。同時數據顯示，SNHG3的表達水平隨著膠質瘤惡性程度的增高而增高(WHOⅠ～Ⅱ級2.110±0.291 vs WHOⅢ～Ⅳ級3.418±0.299，P=0.011)，提示其表達水平與腫瘤的病理級別呈正相關。見圖1。

2 SNHG3的表達與膠質瘤臨床病理指標的關系SNHG3的平均表達水平為2.764±0.280(1.207 ～4.361)，以SNHG3在膠質瘤組織樣本中的表達水平平均值為界值將神經膠質瘤患者分成兩組：SNHG3高表達組(n=42)和SNHG3低表達組(n=28)，結果顯示神經膠質瘤組織中高表達水平的SNHG3與患者的年齡(P=0.622)、性別(P=0.557)、腫瘤大小(P=0.840)以及腫瘤數目(P=0.171)等因素無關，而與高組織學分級(P=0.007)、低KPS評分(P=0.009)以及患者術后復發(fā)(P=0.008)有一定關系。見表1。

3 SNHG3表達水平與膠質瘤患者術后預后的關系

分別用Kaplan-Meier繪制SNHG3低表達組和高表達組的生存曲線，用log-rank進行生存率檢驗，結果發(fā)現，SNHG3表達高者術后預后明顯較差，5年生存率顯著低于低表達者(高表達組31.4% vs低表達組63.0%，P=0.012)，提示SNHG3可能成為預測膠質瘤預后的指標。見圖2。4 SNHG3的表達與膠質瘤臨床病理指標的單因素和多因素分析 為了探究影響預后的獨立因素，我們首先將之前統(tǒng)計的相關臨床病理指標與生存率進行了單因素分析，然后將單因素分析結果中有統(tǒng)計學意義的指標進行多因素COX回歸分析，結果表明膠質瘤組織的SNHG3高表達、高病理級別、KPS評分＜80分以及術后復發(fā)均是影響膠質瘤患者術后預后的獨立危險因素。見表2。

表1 LncRNA-SNHG3表達水平與膠質瘤患者各臨床病理指標的相關性Tab. 1 Correlation between lncRNA-SNHG3 expression level and clinicopathological indicators in glioma patients (n, %)

圖1 LncRNA-SNHG3在正常腦組織和神經膠質瘤組織中的表達水平Fig. 1 Expression level of lncRNA-SNHG3 in normal brain tissue and glioma tissue

圖2 LncRNA-SNHG3高表達組和低表達組患者術后生存率比較Fig. 2 Comparison of postoperative survival rates between lncRNASNHG3 high-expression group and low-expression group

表2 膠質瘤患者不同臨床病理變量與生存率的單變量和多變量分析Tab. 2 Univariate and multivariate analyses of different clinicopathologic variables and survival rates in glioma patients

討 論

神經膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)中惡性程度最高的原發(fā)腫瘤，其具有侵襲力強、易復發(fā)、預后差等特點，尤其是膠質母細胞瘤患者中位生存期僅為1年左右[14]。因其多呈浸潤性生長，手術很難識別出真正的腫瘤邊界，故目前已有的治療方式效果并不是很理想，復發(fā)率較高[15]。為了尋找到一種新的可靠的可預測膠質瘤患者預后的生物學標記物，我們進行了相關研究，希望能尋找到一種新的分子標簽，為今后膠質瘤的早期診斷以及評價預后提供新的方法。

大量研究證實，在腫瘤組織中異常表達的lncRNA可影響腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)如細胞的增殖、分化或者凋亡[16]。這提示一些lncRNA可能作為腫瘤發(fā)生潛在的生物學標記物以及治療靶點。潘俊辰等[17]的實驗首次發(fā)現，lncRNA loc285194在膠質瘤樣本中低表達且與腫瘤的惡性程度存在相關性，上調loc285194的表達對于膠質增殖的影響可能是通過激活其凋亡相關通路發(fā)生，而且腦膠質瘤的生成可能與loc285194的表達缺失有關。此外丁一等[18]的實驗表明SPRY4-IT1在腦膠質瘤組織中的表達量高于瘤周組織，其高表達可能通過影響MAPK信號通路促進膠質瘤細胞的遷移，有可能作為膠質瘤的診斷、判斷預后的分子標志物及治療的分子靶點。而Wang等[19]研究證明在U87和U251中過表達lncRNA-MEG3會抑制膠質瘤細胞的增殖，同時還會促進膠質瘤瘤細胞的凋亡。胡瀧[20]的研究證實SNHG3與細胞的脂質代謝密切相關，SNHG3可能通過介導轉錄因子SREBP-lc來調控肝癌細胞的脂質代謝活動。但是，SNHG3在不同級別膠質瘤中的表達水平和臨床意義卻鮮有相關的研究和結果。

本研究通過分析空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院神經外科2008年6月- 2013年6月收治的70例腦膠質瘤患者的相關病理資料，采用RT-PCR技術檢測SNHG3在不同級別神經膠質瘤組織中的表達量。結果表明其在膠質瘤組織中SNHG3表達量明顯高于正常組織，并且與膠質瘤的病理級別呈正相關，這提示我們SNHG3可能是促進腫瘤組織發(fā)展的原癌基因。進一步通過單因素和多因素分析發(fā)現膠質瘤組織中SNHG3較高水平表達、高病理級別，KPS評分＜80以及術后復發(fā)均為影響預后的獨立因素。生存分析顯示，SNHG3高表達組術后5年生存率顯著低于SNHG3低表達組。

綜上，本研究證實了SNHG3在膠質瘤組織中的表達水平顯著增高，且高表達水平的SNHG3是造成膠質瘤患者不良臨床預后的重要原因。但是我們尚未探討SNHG3促進膠質瘤發(fā)展的作用機制。由于SNHG3在膠質瘤組織中表達上調，接下來我們將主要圍繞SNHG3可能促進膠質瘤發(fā)展的作用機制展開研究，尋找SNHG3的調控或參與的信號通路，從而闡明況SNHG3的調控模式。