王立群，張 娟，丁桂清,，周月希,湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院，湖北武漢 430070；解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖中心，湖北武漢 430070

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女最常見的內(nèi)分泌失調(diào)性疾病之一，主要表現(xiàn)有高雄激素、排卵障礙、多囊卵巢、肥胖、胰島素抵抗、血脂障礙、糖耐量受損等，是造成無排卵性不孕的主要原因[1]。PCOS婦女早期妊娠流產(chǎn)率可達30% ～ 50%，是正常婦女的4倍[2]，此外PCOS患者子宮內(nèi)膜增生過度和子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)的發(fā)生率也較高，是正常女性的2 ～ 3倍[3-4]，PCOS患者雖然在藥物作用下恢復(fù)排卵功能，但是其移植失敗率和自發(fā)性流產(chǎn)率仍然較高[5]，這些都提示患者子宮內(nèi)膜的功能存在失常。目前研究認為PCOS患者子宮內(nèi)膜功能失常主要是由于雌孕激素撤退缺失以及胰島素/葡萄糖通路、黏附分子、細胞因子、炎癥反應(yīng)發(fā)生改變等原因造成[6]。但是由于PCOS患者內(nèi)分泌和代謝障礙對子宮內(nèi)膜造成的影響比較復(fù)雜，致使其子宮內(nèi)膜功能失常的機制還未被完全闡明。本實驗從子宮內(nèi)膜細胞凋亡的角度出發(fā)，通過檢測死亡受體-5(death receptor-5，DR5)和誘騙受體-2(decoy receptor-2，DcR2)蛋白在PCOS大鼠子宮中的表達，探討PCOS子宮內(nèi)膜功能失常的其他可能機制，為臨床降低PCOS患者移植失敗率、自發(fā)性流產(chǎn)率以及子宮內(nèi)膜癌發(fā)生率等治療提供更多的理論依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物 選用21 d齡雌性SPF級SD大鼠20只，體質(zhì)量50 ～ 60 g，由湖北省實驗動物研究中心[SCXX(鄂)2015-0018]提供，在湖北省疾病預(yù)防控制中心屏障環(huán)境[SYXK(鄂)2017-0065]中飼養(yǎng)，溫度控制在(22±2)℃，相對濕度為50% ～60%，自由飲食，光照周期為日夜各12 h。

2 試劑與儀器 硫酸普拉睪酮鈉，青島捷世康生物科技有限公司；DR5、DcR2兔多克隆抗體，Abcom公司；內(nèi)參兔抗β-actin抗體，Proteintech公司。小鼠IgG免疫組化試劑盒，HRP標記羊抗鼠二抗，博士德生物工程有限公司；DAB試劑盒，北京索萊寶生物有限公司；RIPA裂解液、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白濃度定量試劑盒、SDSPAGE凝膠配制試劑盒，碧云天；PVDF膜，美國Millipore公司。YD6L生物組織包埋機，金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；RM2016輪轉(zhuǎn)型切片機，上海徠卡儀器有限公司；BX51奧林巴斯熒光顯微鏡，日本OLYMPUS公司；TGL-16G-A高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；DYY-7C電泳儀、垂直、轉(zhuǎn)移電槽，北京六一儀器廠；RT-6500酶標分析儀，深圳雷杜公司；DB3000凝膠圖像分析儀，天能；各種微量移液器，上海安亭科學儀器廠。

3 動物模型的建立[7-8]21 d齡雌性SD大鼠，斷乳，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，23 d齡時隨機分為兩組，每組10只。其中一組每日按硫酸普拉睪酮鈉90 mg/g皮下注射，相當于脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)60 mg/g，0.4 ml注射用水溶解，連續(xù)注射20 d，以建立PCOS大鼠模型(PCOS組)。另一組設(shè)為對照組，每日皮下注射0.4 ml注射用水，連續(xù)注射20 d。所有大鼠注射后第21日晨用4%水合氯醛麻醉，解剖取卵巢、子宮，分離表面多余組織，固定(4%多聚甲醛)，石蠟包埋，4μm厚切片，行HE染色和免疫組化染色。

4 HE染色 將制備好的卵巢、子宮石蠟切片(4μm)分別脫蠟至水，蘇木素染色1.5 min，流水沖洗返藍，顯微鏡下觀察核藍紫色，100%乙醇浸泡3 min，伊紅染色10 s，100%乙醇浸泡10 s，觀察細胞質(zhì)紅色，晾干，中性樹脂封片后，用倒置顯微鏡觀察卵巢、子宮形態(tài)變化。

5 免疫組織化學染色檢測DR5、DcR2蛋白的表達 取大鼠子宮石蠟切片脫蠟，流水沖洗；3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗；微波抗原修復(fù)，PBS沖洗；山羊血清封閉，不洗；一抗(用PBS按1∶200稀釋的兔抗大鼠DR5抗體和按1∶100稀釋的兔抗大鼠DcR2抗體)4℃過夜；復(fù)溫，PBS沖洗；二抗(生物素標記山羊抗兔IgG，用PBS按1∶150稀釋)37℃孵育35 min；SABC(用PBS按1∶150稀釋)37℃孵育30 min，PBS沖洗；DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間(5 ～10 min)，陽性細胞被染成棕黃色，由Image-Pro Plus計算細胞內(nèi)棕黃色區(qū)域面積(Area)及光密度值(IOD)，平均光密度值(OD)為兩者之比(IOD/Area)，OD值越大，蛋白表達越強。

6 Western blot檢測DR5、DcR2蛋白的表達水平取大鼠子宮組織，加入組織裂解液，碾磨勻漿，離心取上清，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以6μl樣品每泳道行12% SDS-PAGE凝膠電泳，約90 min，根據(jù)目的蛋白分子量切膠，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉奶粉溶液室溫下?lián)u床封閉2 h，相應(yīng)分子量范圍PVDF膜分別加入 DR5(1∶ 500)、DcR2(1∶ 1 000)和β-actin(1∶2 000)4℃孵育過夜，二抗搖床孵育2 h，ECL發(fā)光液顯色，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件進行灰度分析。

7 統(tǒng)計學分析 SPSS19.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以-x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 卵巢和子宮光鏡HE染色檢查 PCOS組大鼠卵巢切面沿包膜下可見多個卵泡呈囊性擴張，黃體形成明顯減少，囊性擴張的卵泡內(nèi)不見卵母細胞或放射冠，卵泡周圍顆粒細胞排列松散，層數(shù)變薄甚至消失，而卵泡膜細胞有增生，對照組大鼠卵巢切面可以看見許多處于不同發(fā)育時期的卵泡，并有多個黃體形成，成熟的卵泡內(nèi)可見卵母細胞及放射冠，其周圍顆粒細胞排列整齊，層數(shù)較厚，可達8 ～ 9層。PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目與對照組相比明顯減少，腺體多為單個分散排列，腺腔比較小，少有紆曲，而對照組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目較多，腺體多呈簇狀排列，腺腔較大，紆曲較多。見圖1。

2 免疫組織化學染色觀察DR5、DcR2的表達DR5、DcR2的陽性表達主要表現(xiàn)為細胞胞質(zhì)和胞膜的棕黃色染色，二者在PCOS組和對照組大鼠子宮中均有陽性表達，主要表達于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，經(jīng)統(tǒng)計分析，DR5在PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中的表達較對照組明顯減弱(P=0.000)，而DcR2在兩組大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的表達無統(tǒng)計學差異(P=0.720)。見表1，圖2。

表1 DR5、DcR2在各組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達Tab. 1 Expression of DR5 and DcR2 in the endometrium of rats in each group

3 Western blot檢測DR5、DcR2蛋白的表達水平

圖1 大鼠卵巢及子宮組織切片光鏡檢查結(jié)果。 PCOS組大鼠卵巢切面沿包膜下可見多個卵泡呈囊性擴張，而對照組大鼠卵巢切面可以看見許多處于不同發(fā)育時期的卵泡。 PCOS組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目與對照組相比明顯減少，腺腔較小，且少有迂曲 A， B：卵巢組織切片(×100)； C， D：子宮組織切片(×200)； A， C： PCOS組； B， D： 對照組Fig. 1 Histological features of ovarian tissue (A, B. HE staining, ×100) and uterine tissue (C, D. HE staining, ×200). A, C) PCOS group. B, D)Control group. In the PCOS group, multiple follicles showed cystic dilatation along the subcapsular ovary, while many ovarian cuts in the control group showed follicles at different developmental stages. The number of endometrial glands in the PCOS group signif i cantly reduced compared with the control group. The glandular cavity was small, and there was little distortion

圖2 大鼠卵巢及子宮免疫組織化學檢查結(jié)果。 DR5和DcR2主要表達于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，DR5在PCOS組中的表達情況較對照組明顯減弱，DcR2在兩組中的表達無顯著差異 A， B： DR5免疫組化染色技術(shù)應(yīng)用切片(SABC法，×400)； C， D： DcR2免疫組化染色技術(shù)應(yīng)用切片(SABC法，×400)； A， C：PCOS組； B， D： 對照組Fig. 2 Immunohistochemical staining images showed DR5 and DcR2 expression in uterine tissue (SABC method，×400). (A) Lack of DR5 expression in PCOS group. (B) Strong membrane expression of DR5 in control group (C) Lack of DcR2 expression in PCOS group. (D)Lack of DcR2 expression in control group

DR5在PCOS組和對照組大鼠子宮中相對表達量分別為0.997±0.021、1.282±0.015，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，PCOS組大鼠子宮DR5蛋白的表達明顯降低；DcR2在PCOS組和對照組大鼠子宮中相對表達量分別為0.906±0.078、0.860±0.064，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.474)。見圖3。

圖3 Western blot檢測DR5、DcR2蛋白的表達水平Fig. 3 Western blot was used to detect the expression of DR5 and DcR2 proteins

討 論

自1976年Hopwood和Levison[9]發(fā)現(xiàn)人的子宮內(nèi)膜存在細胞凋亡小體以來，越來越多的研究表明子宮的許多病理變化都與細胞凋亡密切相關(guān)。Yan等[10]通過對PCOS患者子宮內(nèi)膜進行研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者種植窗期子宮內(nèi)膜的凋亡指數(shù)與對照組相比顯著降低，他們還發(fā)現(xiàn)9種與細胞凋亡相關(guān)基因的表達發(fā)生了變化，其中B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，BcL-2)的表達顯著上調(diào)，F(xiàn)as相關(guān)死亡域蛋白(Fas-associated with death domain protein，F(xiàn)ADD)的表達顯著下調(diào)。Kuyucu等[1]研究表明PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的凋亡情況與對照組相比明顯增加，細胞凋亡過程中主要的效應(yīng)因子Caspase-3的表達也顯著升高，這些研究均表明PCOS子宮內(nèi)膜的凋亡情況發(fā)生了改變。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)作為腫瘤壞死因子超家族的一員，它通過與4種高親和力的受體結(jié)合在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，其中DR4和DR5與TRAIL結(jié)合后會誘導(dǎo)細胞凋亡，DcR1和DcR2由于缺乏內(nèi)源性死亡結(jié)構(gòu)域，它們與TRAIL結(jié)合后不僅不會誘導(dǎo)細胞凋亡，還可以與死亡受體競爭結(jié)合TRAIL而起到保護細胞的作用[11]。這說明TRAIL受體的表達水平影響著由TRAIL介導(dǎo)的細胞凋亡情況。有許多學者對TRAIL受體在子宮內(nèi)膜癌中的表達情況進行過研究[12-14]。但是有關(guān)于TRAIL受體在PCOS子宮內(nèi)膜中表達情況的研究目前鮮有報道。

本研究中，我們首先構(gòu)建了PCOS大鼠模型，然后通過免疫組織化學法和免疫印跡法檢測DR5和DcR2的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種TRAIL受體主要表達于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，DR5在PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的表達水平較對照組降低，DcR2在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達水平無明顯差異。我們推測，在正常的子宮內(nèi)膜中，TRAIL及其受體的表達水平之間可能存在一定比例，使TRAIL所介導(dǎo)的促細胞凋亡作用和抗細胞凋亡作用之間維持著一種平衡，而在PCOS大鼠子宮內(nèi)膜中，由于DR5的表達水平發(fā)生了變化，破壞了這一比例，導(dǎo)致了TRAIL所介導(dǎo)的促凋亡和抗凋亡作用的失衡，從而影響了PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的凋亡情況，進而對內(nèi)膜的功能造成了一定影響。

EC是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，為女性生殖道三大惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[15]。Haoula等[16]研究表明，與沒有患PCOS的女性相比，患有PCOS的女性發(fā)生EC的可能性大約是前者的3倍，但是PCOS與EC之間的確切聯(lián)系目前還不清楚。Gottwald等[12]發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜樣腺癌中，DR5的表達較正常子宮內(nèi)膜是顯著降低的，李曉蘭等[17]發(fā)現(xiàn)在EC的早期階段，DR5的表達明顯減少，DcR2的表達無明顯改變。由于DR5的下調(diào)可以減少TRAIL所誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡[18]，有學者認為在EC的早期，子宮內(nèi)膜癌細胞發(fā)生了凋亡逃逸，導(dǎo)致腫瘤細胞快速生長，從而發(fā)展成為EC。由于PCOS患者發(fā)生EC的風險較高，在本次研究中TRAIL受體DR5和DcR2在PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的表達情況又與EC早期相似，由此我們推測DR5在子宮內(nèi)膜表達水平的降低可能是導(dǎo)致PCOS發(fā)生EC的因素之一，但其中的具體機制尚不明確，仍需我們進一步研究。

綜上所述，我們認為DR5和DcR2在PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的表達變化可能在PCOS子宮內(nèi)膜功能發(fā)生失常的過程中起到了一定作用，這為闡釋PCOS子宮內(nèi)膜功能失常的機制提供了一個新的可能，也為臨床上降低PCOS患者移植失敗率、自發(fā)性流產(chǎn)率以及子宮內(nèi)膜癌發(fā)生率等提供了更多的理論依據(jù)。