陳志達(dá)，張鵬飛，郗洪慶，戴廣海，衛(wèi) 勃，陳 凜

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1普通外科；2普通外科研究所；3腫瘤內(nèi)科

組蛋白去乙?；窰DAC6是細(xì)胞質(zhì)中存在的一種重要的去乙?；?，在人體內(nèi)的分布具有組織特異性，在心、肝、腎、胰等臟器中高表達(dá)[1]。1999年，Grozinger和Verdel兩個(gè)獨(dú)立的研究小組通過克隆方法首次獲得了hdac6基因。研究發(fā)現(xiàn)hdac6基因定位于Xp11.23染色體上，大小約為3 645 bp，轉(zhuǎn)錄翻譯后HDAC6由1 215個(gè)氨基酸組成[2]。HDAC6作為一種重要的去乙?；竿ㄟ^使特異性底物脫掉Lys(賴氨酸)乙?；鶃砭S持組蛋白乙?；腿ヒ阴；钠胶狻，F(xiàn)有研究已經(jīng)確認(rèn)的HDAC6底物主要有微管蛋白a-tubulin、熱休克蛋白Hsp90和皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白Cortactin[3]。近年來研究表明，誘發(fā)腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要的分子學(xué)機(jī)制是組蛋白表觀修飾乙?；腿ヒ阴；嗷ジ?jìng)爭(zhēng)的平衡被打破。HDAC6通過去除組蛋白的乙酰基調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄過程，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到十分關(guān)鍵的作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、口腔癌等惡性腫瘤中均存在HDAC6高表達(dá)現(xiàn)象[5-7]。為進(jìn)一步研究HDAC6的功能特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)hdac6引物并擴(kuò)增出基因編碼區(qū)全長(zhǎng)，將其構(gòu)建在原核表達(dá)載體上，通過誘導(dǎo)純化的方式獲得HDAC6的融合蛋白，然后用還原性谷胱甘肽進(jìn)行洗脫后使微管蛋白a-tubulin去乙酰化，并初步驗(yàn)證其功能，為深入研究去乙?；窰DAC6在調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 pGEX-KG原核表達(dá) 載體、DH5α大腸埃希菌和BL21感受態(tài)細(xì)胞、人乳腺文庫(kù)為本室保存。限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶和PCR試劑購(gòu)自于寶生物工程(TaKaRa)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒采購(gòu)自天根(北京)生化科技有限公司；PCR引物由賽百盛公司合成；GST-Sepharose 4B購(gòu)自Pharmacia；GSTHRP、ac-tubulin、α-tubulin抗體購(gòu)自圣克魯斯(上海)生物技術(shù)公司(Santa Cruz)；測(cè)序由奧科鼎盛生物科技有限公司(北京)完成。

2 去乙酰化酶HDAC6全長(zhǎng)編碼區(qū)基因的擴(kuò)增結(jié)合賽百盛公司提供的引物設(shè)計(jì)原則，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的去乙?；窰DAC6序列我們?cè)O(shè)計(jì)合成引物。上游引物：5'-GCTCTAGACATGACCTCAACCG GCCAGG-3'；下游引物：5'-CCCAAGCTTTTAGTG TGGGTGGGGCATATC-3'，其中上游引物中包含限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，下游引物中包含限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ的酶切位點(diǎn)。以人乳腺文庫(kù)為模板，利用PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法擴(kuò)增HDAC6序列。按以下條件進(jìn)行HDAC6編碼區(qū)全長(zhǎng)的擴(kuò)增[8]：1.95℃環(huán)境預(yù)變性，時(shí)間5 min；2.95℃環(huán)境正式變性，時(shí)間30 s；3.58℃環(huán)境退火，時(shí)間30 s；4.72℃環(huán)境延伸，時(shí)間5 min。將上述4個(gè)步驟循環(huán)進(jìn)行31次，然后行最后一次延伸，溫度要求72℃環(huán)境，延長(zhǎng)時(shí)間7 min。擴(kuò)增得到的DNA產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，若為目標(biāo)DNA，最后以瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收提取PCR產(chǎn)物。

3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ雙酶切pGEX-KG表達(dá)載體，37℃環(huán)境下酶切4 h，繼而在濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳、膠回收載體大片段；以同樣的方法將PCR片段回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，形成特異性黏性末端的雙鏈DNA，使用T4-DNA連接酶接入pGEX-KG表達(dá)載體中，16℃恒溫下連接處理12 h。接下來，轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌菌株，挑取適宜的單克隆菌落，搖菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的克隆送奧科鼎盛生物科技有限公司(北京)測(cè)序。

4 GST-HDAC6融合蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)鑒定選取鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒，使用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后挑選適應(yīng)的陽(yáng)性單克隆或菌落，加入到LB溶液中，37℃環(huán)境震蕩培養(yǎng)2 ～3 h。使用分光光度儀測(cè)試溶液濁度，若達(dá)到A600nm=0.7 ～ 0.9，加入誘導(dǎo)劑 IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，致其最終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)在37℃環(huán)境中，連續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后12 000 r/min高速離心，丟棄上清液，保留菌體沉淀以備進(jìn)行SDS-PAGE染色和Western blot蛋白含量檢測(cè)。

5 GST-HDAC6融合蛋白的純化與洗脫 將轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pGEX-KG-HDAC6和表達(dá)載體pGEXKG的BL21感受態(tài)菌株接種于含有氨芐青霉素(Ampicillin)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫環(huán)境震蕩培養(yǎng)4 ～ 9 h，過夜活化。按2%的體積比例，吸取活化的溶液轉(zhuǎn)種于另一組LB液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫環(huán)境震蕩培養(yǎng)，使用分光光度儀測(cè)試溶液濁度，若達(dá)到A600nm=0.5 ～ 0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，致其最終濃度為0.1 mmol/L。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至20℃恒溫環(huán)境，繼續(xù)持續(xù)震蕩培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)結(jié)束后12 000 r/min高速離心，丟棄上清液，保留菌體沉淀，按照法瑪西亞(Pharmacia)公司提供的實(shí)驗(yàn)說明完成融合蛋白的純化：1)在收集到的菌體中加入裂解液，4℃環(huán)境(通常冰浴)進(jìn)行超聲波裂解、破碎；2)設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心收集裂解液上清；3)在上清液中加入適量瓊脂糖凝膠GST-Sepharose 4B，持續(xù)4℃環(huán)境旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h；4)低速離心離心收集瓊脂糖凝膠GST-Sepharose 4B顆粒，轉(zhuǎn)速維持在3 000 r/min；5)最后采用SDS-PAGE染色的方法鑒定融合蛋白的純化效果。

6 去乙?；瘜?shí)驗(yàn)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性 具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[9]：利用還原性谷胱甘肽小量(35μl/次)多次將GST-HDAC6從beads上逐漸洗脫，同時(shí)洗脫GST蛋白作為陰性對(duì)照。使用RIPA裂解293T細(xì)胞，并對(duì)裂解的細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量分析。將洗脫后的10μg還原性谷胱甘肽與含有30μg蛋白的RIPA裂解液混合加入到反應(yīng)溶液中，37℃共同孵育2 h后，進(jìn)行SDS-PAGE以及放射顯影[反應(yīng)溶液的成分為15 mmol Tris(pH 7.9)、10 mmol NaCl、0.25 mmol EDTA、10 mmol b-2-mercaptoethanol和 10% glycerol]。

結(jié) 果

1 去乙?；窰DAC6編碼區(qū)基因DNA的克隆以人乳腺文庫(kù)為模板，按一定條件經(jīng)過變性、退火和延伸等過程，擴(kuò)增出HDAC6編碼區(qū)全長(zhǎng)的序列，最終獲得的PCR產(chǎn)物大小約3 645 bp，符合預(yù)期片段大小(圖1)。

2 重組表達(dá)載體pGEX-HDAC6重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ雙酶切后，同法酶切pGEX-KG表達(dá)載體，將兩者連接。轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α菌株，挑選適應(yīng)的陽(yáng)性單克隆或菌落，采用試劑盒提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切特異性鑒定。結(jié)果提示：在凝膠電泳中可以見到與預(yù)期片段3 645 bp大小相符的外源基因插入片段(圖2)，對(duì)照空載體在經(jīng)過雙酶切后卻沒有此片段，表明pGEX-KG上游的多克隆位點(diǎn)中已經(jīng)插入去乙酰化酶HDAC6的基因序列。奧科鼎盛生物科技有限公司(北京)DNA序列測(cè)序結(jié)果回報(bào)，擬構(gòu)建的重組質(zhì)粒與已知目標(biāo)序列完全一致，沒有發(fā)生突變(數(shù)據(jù)省略)。

3 GST-HDAC6融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 經(jīng)鑒定正確表達(dá)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21菌株，經(jīng)過誘導(dǎo)劑IPTG小量誘導(dǎo)后，離心收集菌體?？捡R斯亮藍(lán)染色鑒定和Western blot蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，獲取的融合蛋白GST-HDAC6能夠正確表達(dá)(圖3)。

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增 m:BM2000+1.5K DNA標(biāo)記; 1:退火溫度在58℃時(shí)的PCR產(chǎn)物Fig. 1 Target gene PCR amplification m:BM2000 +1.5K DNA marker; 1: PCR products at 58℃ annealing temperature

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定 m: BM2000+1.5K DNA標(biāo)記;1: pGEX-KG+XbaⅠ+HindⅢ; 2: pGEX-HDAC6+XbaⅠ+HindⅢFig. 2 Recombinant plasmid enzyme digestion quali fi cation m: BM2000+1.5K DNA Marker; 1: pGEX-KG+XbaⅠ+HindⅢ; 2: pGEX-HDAC6 + XbaⅠ+HindⅢ

圖3 融合蛋白GST-HDAC6的SDS-PAGE和Western blot蛋白檢測(cè)分析 a: SDS-PAGE ; b: Western blot. m: 蛋白標(biāo)記; 1:pGEX-KG空載體誘導(dǎo)前; 2: pGEX-KG空載體誘導(dǎo)后; 3:pGEX-KG-HDAC6誘導(dǎo)前; 4:重組質(zhì)粒 pGEX-KG-HDAC6誘導(dǎo)后，圖示位置為表達(dá)蛋白條帶Fig. 3 SDS-PAGE and Western-blot results of GST-HDAC6 fusion protein a: SDS-PAGE ; b: Western blot. m: protein marker; 1: pGEX-KG before induction; 2: pGEX-KG after induction; 3: pGEX-KG-HDAC6 before induction; 4:Recombinant plasmid pGEX-KG-HDAC6 after induction

圖4 GST-HDAC6融合蛋白純化SDS-PAGE分析m：蛋白標(biāo)記； 1：GST空載體蛋白； 2：GSTHDAC6蛋白Fig. 4 SDS-PAGE of GSTHDAC6 fusion protein purif i cation m: protein marker； 1:GST protein； 2: GSTHDAC6 protein

圖5 去乙?；瘜?shí)驗(yàn)檢驗(yàn)GST-HDAC6生物活性Fig. 5 GST-HDAC6 showed great enzyme activity by deacetylation experimental verif i cation

4 融合蛋白GST-HDAC6的純化 利用法瑪西亞(Pharmacia)公司的瓊脂糖凝膠GST-Sepharose 4B親和珠純化后融合蛋白?？捡R斯亮藍(lán)染色后結(jié)果提示通過系統(tǒng)純化，獲取到部分純度較高的GST蛋白和GST-HDAC6蛋白(圖4)。

5 去乙酰化酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白活性 將之前洗脫的GST-HDAC6、5μg GST蛋白與α-tubulin共同孵育后，進(jìn)行SDS-PAGE和放射顯影，結(jié)果顯示，純化的GST-HDAC6能夠使α-tubulin去乙?；獹ST卻不能使之發(fā)生這樣的變化，說明純化的HDAC6蛋白具有一定的生物學(xué)活性(圖5)。

討 論

現(xiàn)代腫瘤理論認(rèn)為，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與遺傳基因的表觀遺傳學(xué)改變密切相關(guān)。表觀遺傳學(xué)改變雖然不影響DNA序列，但它可以從轉(zhuǎn)錄水平影響基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控DNA功能表達(dá)，具體機(jī)制可能與DNA自身化學(xué)修飾有關(guān)。在眾多的修飾方式中，組蛋白的乙酰化和去乙?；揎棸l(fā)揮著關(guān)鍵性作用。組蛋白乙酰化的水平是去乙?；负鸵阴；D(zhuǎn)移酶動(dòng)態(tài)競(jìng)爭(zhēng)后的結(jié)果。乙?；揎棔r(shí)(乙酰轉(zhuǎn)移酶HATs發(fā)揮作用)，通過瓦解氨基末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)并中和組蛋白所帶的正電荷以及疏水的乙?；鶊F(tuán)產(chǎn)生的空間阻力，降低組蛋白與DNA的親和力，舒展核小體結(jié)構(gòu)，從而激活基因轉(zhuǎn)錄；而去乙?；?HDACs)使組蛋白發(fā)生去乙?；?，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。由此可見，特定基因的表達(dá)狀態(tài)取決于被轉(zhuǎn)錄因子定位在靶基因啟動(dòng)子上的HATs和HDACs間的動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡被打破，就容易誘發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。

HDAC6是HDAC家族中的一員，屬于Ⅱ類HDAC去乙?；浮＝陙?，在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、口腔癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)HDAC6具有明顯的差異性表達(dá)現(xiàn)象，這也使其成為防癌、控癌的研究熱點(diǎn)[11-14]。雖然具體機(jī)制并未完全闡明，但目前研究結(jié)果表明，HDAC6調(diào)控腫瘤的機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面：1)對(duì)反應(yīng)底物微管和Hsp90去乙?；?，從轉(zhuǎn)錄水平出發(fā)，抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，減弱腫瘤的轉(zhuǎn)移能力和血管的速度；2)結(jié)合泛素以維持去乙?；幕钚?，濃集染色質(zhì)破壞正常基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)；3)結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制因子，沉默抑癌基因的表達(dá)[15-18]。

微管蛋白a-tubulin是最早被發(fā)現(xiàn)的HDAC6底物，能夠被HDAC6去乙酰化。在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功構(gòu)建去乙?；傅腍DAC6原核表達(dá)載體，利用GST-Sepharose 4B對(duì)融合蛋白進(jìn)行了純化，并利用體外去乙?；瘜?shí)驗(yàn)成功降低tubulin的乙酰化水平，證明純化的GST-HDAC6融合蛋白具有較好的生物學(xué)活性，為接下來在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究HDAC6調(diào)控乙?；c腫瘤之間的關(guān)系奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。